神经肌肉超声作为SOD1小鼠模型肌萎缩侧索硬化症中的生物标志物

《PLOS One》：Neuromuscular ultrasound as a biomarker in the SOD1 mouse model of amyotrophic lateral sclerosis

　　

针对迄今为止无法治愈的神经退行性疾病肌萎缩侧索硬化症（ALS），亟需能够指示早期疾病相关变化和治疗反应的进展标志物。近几十年来，将已在体内模型中成功验证的治疗方法转化为针对人类患者的临床试验一直困难重重。这种失败至少可以部分归因于人类ALS患者以及体内模型中缺乏用于ALS诊断和进展的特异性生物标志物。神经肌肉超声是一种易于获取、非侵入性的工具，可用于支持人类ALS的诊断。本研究首次表明，借助神经肌肉超声可以在ALS小鼠模型中检测到该疾病。研究人员使用不同技术（神经肌肉超声、神经电图、运动功能测试、表型评估和组织学）表征了SOD1^G93A小鼠模型中后肢周围神经和肌肉变化的疾病进展。通过神经肌肉超声，研究人员测量了坐骨神经的横截面积和直径，并分析了后肢肌肉的纹理和厚度。研究结果表明，运动神经元丢失和肌肉萎缩——类似于人类ALS——可以通过超声在SOD1^G93A小鼠模型中测量到。神经和肌肉形态的变化出现在该模型中已建立的体内检测（包括神经电图测量）发生变化的同时甚至更早。与疾病进展组织学特征的相关性使神经肌肉超声成为临床前研究中一个敏感、非侵入性的结果标志物。

解读文章

研究背景、问题与目的

肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic lateral sclerosis, ALS）是最常见的成人发病运动神经元疾病，临床表现为肌无力、肌肉萎缩、构音障碍、吞咽困难、体重下降和呼吸功能不全，通常在发病后3-5年内导致死亡。目前，疾病修饰治疗选择有限：谷氨酸拮抗剂利鲁唑（Riluzole）疗效温和，而自由基清除剂依达拉奉（Edaravone）仅在少数国家获批且其益处在III期研究中未得到证实。近期，针对具有SOD1（超氧化物歧化酶1）、C9orf72和FUS（肉瘤融合基因）基因突变的家族性ALS患者出现了有前景的治疗策略，但这些策略仅适用于最多10%的ALS患者。对于散发性ALS，过去几十年来，超过50种不同作用机制的药物在体内模型的临床前研究中显示出有希望的结果，但向临床试验的转化极易失败。这些阴性结果可能反映了疾病的临床和病理生理异质性，以及缺乏用于充分量化疾病进展和治疗反应的生物标志物。虽然神经丝蛋白作为ALS的“液体”诊断和预后生物标志物受到关注，但疾病进展通常通过手动力量测试、ALS功能评定量表和King’s分期进行常规监测。高频诊断超声是一种易于获取、非侵入性的方法，用于评估周围神经和肌肉的结构变化，在此应用中被称为神经肌肉超声。在人类ALS中，神经肌肉超声是用于诊断和评估疾病进展的既定方法：它可以检测肌束震颤（作为下运动神经元损伤的早期征象），其敏感性高于肌电图。此外，四肢横纹肌的数量（以厚度衡量）会减少并在病程中持续下降。肌肉厚度的下降与ALSFRS-R评分相关。回声强度作为衡量肌肉质量的指标，与肌力相关，其变化先于临床上明显的麻痹发生。周围神经超声已显示颈神经根萎缩以及正中神经和尺神经的近端萎缩，表现为横截面积减小和远端-近端比值增加。因此，尽管并非常规应用，神经肌肉超声为监测疾病进展提供了最佳特性。在ALS体内模型的临床前研究中，用于量化疾病进展的生物标志物包括体重减轻、力量测试、步态分析和研究者特异性的神经学评分系统。首个且最特征化的ALS动物模型是突变的SOD1^G93A小鼠，该小鼠过表达突变的人类SOD1，并发展出类似于人类疾病的成年发病运动神经元疾病。不同的病理机制汇聚于脊髓中运动神经元丢失，随后出现后肢和前肢的肌肉萎缩和无力。疾病进展最常见的量化指标包括体重减轻、麻痹严重程度评分、转棒实验、悬挂线实验、步长和运行时间。神经传导研究和运动单位数目估计（MUNE）也有应用。所有这些技术都有局限性，包括操作者变异性、缺乏敏感性以及需要麻醉或安乐死的侵入性。此外，它们不能直接转化为人类疾病，在人类疾病中分期基于更细微的功能评分。在本研究中，研究人员旨在将神经肌肉超声确立为ALS突变SOD1^G93A小鼠模型中疾病分期的生物标志物。研究人员在病程中的三个症状前期和三个症状期时间点对坐骨神经和肢体肌肉进行了超声检查，并将结果与已建立的生物标志物（如运动表现测试、体重、神经传导研究以及疾病的组织学标志）进行比较。研究人员成功定义了一种新的、敏感的、非侵入性的、适用于人类疾病和小鼠模型的生物标志物，并评估了体内神经和肌肉的形态测量。

主要关键技术方法

本研究从美国Jackson Laboratory获取了转基因SOD1^G93A小鼠（B6.Cg-Tg(SOD1*G93A)1Gur/J），并以野生型同窝小鼠为对照组。在六个不同时间点（7、10、13、16、19和22周龄）对转基因和野生型小鼠进行比较。关键方法包括：使用Vevo? 2100成像系统（40 MHz探头）进行神经肌肉超声检查，测量坐骨神经的横截面积（CSA）、直径、后肢肌肉厚度和回声强度；使用IITC转棒仪、悬挂网和足迹分析进行运动功能评估；使用Natus Keypoint Focus设备进行神经电图检查，记录复合肌肉动作电位（CMAP）振幅、潜伏期和神经传导速度（NCV）；以及通过Nissl染色和免疫荧光染色进行脊髓运动神经元计数、星形胶质细胞增生和小胶质细胞增生的组织学评估，并对坐骨神经进行组织形态测量学分析及对神经肌肉接头（NMJ）进行免疫染色分析。

研究结果

**Changes in the sciatic nerve and muscles of the hind limbs in mutant SOD1G93A mice can be visualized successfully using Neuromuscular ultrasound**：通过使用神经肌肉超声，成功可视化了突变SOD1^G93A小鼠后肢软组织结构，包括坐骨神经和肌肉。该技术耐受性良好，易于学习且可重复。

**Evaluation of nerve morphology shows early decrease in nerve cross-sectional area and diameter in mutant SOD1G93A mice**：研究发现，与野生型小鼠相比，突变SOD1^G93A小鼠在10、13、16、19和22周龄时，远端坐骨神经直径显著减小。近端坐骨神经CSA在19周龄时显著减小。ROC分析显示，远端坐骨神经直径从7周龄起即可有效区分转基因和野生型小鼠，其AUC（曲线下面积）≥0.7。

**Evaluation of muscle morphology shows a decrease in thickness and an increase in echo intensity in mutant SOD1G93A mice**：突变SOD1^G93A小鼠腓肠肌的开口角在10周龄及以后显著小于野生型。股二头肌厚度在13周龄及以后显著减小，回声强度在13周龄及以后显著增加。ROC分析显示，股二头肌回声强度从13周龄起可有效区分转基因和野生型小鼠。

**Phenotypic changes in mutant SOD1G93A mice occur at the same time or after changes detectable by neuromuscular ultrasound**：突变SOD1^G93A小鼠体重从10周龄开始显著下降，一般状况在19周龄时恶化。运动功能（转棒、悬挂线、步长）在16周龄及以后才出现显著差异。这表明超声可检测到的变化先于或与标准表型评估中的变化同时发生。

**Differences in the electroneurography occur at the same time as the changes in the neuromuscular ultrasound**：从腓肠肌和前胫骨肌记录的CMAP振幅在10周龄及以后显著降低，从跖肌记录的在13周龄开始降低。运动潜伏期在16周龄及以后延长，NCV在16和19周龄时减慢。这些变化与超声发现改变的时间点部分重叠或稍晚。

**Histologically significant differences between mutant SOD1G93A and wild-type mice can only be detected after the changes in the ultrasound examinations**：脊髓运动神经元数量在13周龄时显著减少，同时星形胶质细胞增生增加，小胶质细胞增生在16周龄时增加。坐骨神经组织学上，在22周龄时观察到异常纤维比例显著增加，轴突直径在13和19周龄时显著减小。神经肌肉接头（NMJ）数量从13周龄起显著减少，并伴有形态学改变。这些组织学变化大多发生在超声可检测到变化之后。

讨论与结论

讨论部分指出，SOD1^G93A小鼠会发展出快速进展的运动神经元疾病。当前的结果指标（体重减轻、麻痹严重程度、运动测试和神经传导研究）在评估疾病进展和实验性药物效果方面仅为中等程度的满意标志物。本研究成功展示了：1. 神经肌肉超声在SOD1^G93A小鼠模型中可行；2. 神经和肌肉形态测量的变化与人类ALS中描述的变化相似；3. 超声形态学变化先于或与用于表征该小鼠模型疾病进展的标准技术中出现异常的时间点一致。超声检测到的神经和肌肉变化与CMAP振幅、运动神经元数量和NMJ数量显著相关。ROC分析表明，远端坐骨神经直径和股二头肌回声强度是可靠的诊断参数。总之，本研究首次全面比较了侵入性和非侵入性技术，并表明神经肌肉超声可作为SOD1^G93A小鼠模型中疾病进展的早期且可靠的标志物。考虑到其非侵入性和可重复性，神经肌肉超声是评估该ALS模型中新治疗策略疗效的最佳工具，因此，加入神经肌肉超声可能会提高未来临床转化的可能性。

研究结论：研究人员成功定义了一种新的、敏感的、非侵入性的生物标志物，该生物标志物适用于人类疾病和小鼠模型，并评估了体内神经和肌肉的形态测量。