TB-SERS分析仪：基于机器学习与卷积神经网络的拉曼光谱结核病预测分析工具

《PLOS Computational Biology》：TB-SERS analyzer: Analysis tool for tuberculosis prediction based on Raman spectroscopy with machine learning and convolutional neural network

　　

拉曼光谱（Raman spectroscopy, RS）和表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）是具有前景的技术，已应用于包括临床诊断在内的多个领域。在结核病（tuberculosis, TB）诊断方面，RS/SERS在快速、无创、灵敏的生物分子检测方面展现出显著潜力。然而，目前尚无专为分析RS/SERS数据进行结核病诊断而设计的软件。研究人员的目标是通过将机器学习（machine learning, ML）和一维卷积神经网络（one-dimensional convolutional neural network, 1D-CNN）集成到用户友好的图形用户界面（graphical user interface, GUI）中，开发这样一种工具。研究人员推出了TB-SERS Analyzer，这是一个基于Python的具有GUI的工具，用于使用SERS数据进行结核病预测。研究人员使用干扰素-γ释放试验（interferon-gamma release assay, IGRA）建立了一个包含1000份血浆样本（500份IGRA阳性，500份IGRA阴性）的参考数据库。TB-SERS Analyzer允许用户输入光谱数据并自动生成结核病诊断报告。ML和1D-CNN模型通过五折分层交叉验证进行训练和优化。研究人员评估了七种算法，以确定最有效的结核病分类方法。1D-CNN模型在验证集（n = 200）中实现了82.00%的敏感性和76.00%的特异性。在盲法外部测试（n = 20）中，该模型保持了80.00%的敏感性，特异性为100%。该软件包含四个集成模块：（1）患者数据提取，（2）数据准备，（3）ML和1D-CNN分析，以及（4）诊断报告生成。TB-SERS Analyzer在结核病筛查中展现出高效率，每个样本的分析时间不到10秒。TB-SERS Analyzer是一种有效且易于使用的结核病筛查工具，将RS/SERS技术与ML和1D-CNN模型相结合。该软件可在GitHub上免费获取，网址：https://github.com/jkeisiri/TB-SERS-Analyzer。

论文解读文章

**研究背景与问题**
结核病（tuberculosis, TB）仍是全球面临的重大公共卫生挑战，由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起。2022年全球约130万人死于结核病，约四分之一人口感染该病菌。潜伏性结核感染（latent tuberculosis infection, LTBI）状态下，宿主免疫系统持续对Mtb抗原产生应答但无临床症状，约5-10%的感染者最终会发展为活动性结核病。目前，诊断LTBI的金标准尚未建立，现有筛查方法如干扰素-γ释放试验（interferon-gamma release assay, IGRA）、结核菌素皮肤试验（tuberculin skin test, TST）和基于Mtb抗原的皮肤试验（TBST）耗时、费力且昂贵。IGRA无法区分活动性TB与LTBI，且敏感性和特异性仍较低。为了实现世界卫生组织终结结核病战略的目标，亟需更有效的筛查工具。拉曼光谱（Raman spectroscopy, RS）和表面增强拉曼光谱（surface-enhanced Raman spectroscopy, SERS）技术可分析病原菌的化学成分，已在COVID-19检测、分枝杆菌鉴别及结核病检测中展现出潜力。然而，现有研究大多集中于模型开发，缺乏整合了强大机器学习（machine learning, ML）/深度学习（deep learning, DL）算法的、用户友好的结核病专用软件平台。因此，研究人员旨在开发一款能够利用RS/SERS光谱数据生成结核病诊断报告的软件，基于此前1000例样本的研究，提供准确、易用的诊断输出。

**主要技术方法**
研究人员使用Python 3.8开发了TB-SERS Analyzer，基于PyQt5构建图形用户界面（GUI），采用scikit-learn和TensorFlow/Keras实现ML与DL模型。数据来源为1000份人血浆样本（500份IGRA阳性[IGP]，500份IGRA阴性[IGN]），均来自此前已发表的研究（[13]）。每个样本通过7×7拉曼映射网格采集49个光谱，波数范围620-1720 cm^-1，共1011个数据点。预处理包括：宇宙射线去除（改进Z分数法，阈值8）、基于主成分分析（principal component analysis, PCA）和马氏距离（最小协方差行列式，90%置信阈值）的异常值检测与剔除、三阶多项式基线校正、强度归零及标准正态变量（standard normal variate, SNV）归一化。模型优化采用分层五折交叉验证，ML算法（线性判别分析[LDA]、逻辑回归[LR]、随机森林[RF]、支持向量机[SVM]、K近邻[KNN]、极端梯度提升[XGB]）通过GridSearchCV调参，一维卷积神经网络（1D-CNN）通过手动调优设计（四个卷积层，核大小3，滤波器数16、32、64、128，批归一化、Leaky ReLU激活、平均池化、全连接层128神经元、sigmoid输出）。性能评估指标包括ROC-AUC、敏感性、特异性等，通过bootstrap法（1000次迭代）计算95%置信区间。外部验证使用20份盲法血浆样本。

**研究结果**

* **Comparative performance of machine Learning algorithms and 1D-CNN for IGRA classification**：通过对训练集（n=800）进行五折分层交叉验证，比较了七种候选算法的诊断性能。1D-CNN模型展现出最优的整体判别能力，AUC最高（0.885，95% CI: 0.86-0.90），准确率77.50%，敏感性75.50%。传统ML模型中XGB（AUC=0.872）和RF（AUC=0.865）表现接近，但DeLong检验表明1D-CNN显著优于LR、LDA、KNN（p<0.001）、SVM（p=0.005）和RF（p=0.013），与XGB无显著差异（p=0.124）。最终1D-CNN因AUC更高被选为TB-SERS Analyzer的核心架构。

* **Sub-region performance analysis and biomolecular interpretation**：为解释1D-CNN的生化基础，将指纹区（620-1720 cm^-1）分为六个子区间。其中1000-1200 cm^-1区间诊断性能最佳（AUC=0.805），但全谱模型AUC（0.885）更高。IGP与IGN组的平均SERS光谱在1000-1200 cm^-1区间内发现多个显著差异峰，包括1003 cm^-1（苯丙氨酸）、1030 cm^-1（蛋白质/C-C骨架）、1050 cm^-1（C-N和C-C伸缩）、1097 cm^-1（核酸/磷酸盐伸缩）和1139 cm^-1（蛋白质CH₂和CH₃弯曲）。Mann-Whitney U检验证实这些峰强度差异高度显著（多数p<0.001），例如1003 cm^-1峰在IGP组显著降低，1050 cm^-1峰则升高（p=0.008）。这表明1D-CNN模型决策与血浆中的特定生化改变有效相关。

* **Threshold optimization and performance across margin-based prediction tiers in TB-SERS Analyzer**：利用Youden指数在训练集ROC曲线上确定最优阈值为0.581，此时敏感性72.00%，特异性86.70%。基于预测概率与阈值之差的绝对边际值，将预测分为低、中、高三个层级（分界点0.2317和0.4176）。高层级在验证集中准确率达95.5%（n=89），而低层级准确率较低（48.2%），表明存在边界预测。通过等渗回归进行概率校准，校准后预测概率与观察结果的一致性改善，且判别能力未受影响。该分层方法有助于更细致地解读模型预测。

* **Validation and external blind testing of the TB-SERS Analyzer**：使用整个训练集（n=800，预留20%即160样本作为训练内验证集用于早停）重新训练1D-CNN模型。在独立内部验证集（n=200）和外部盲法测试集（n=20）上评估泛化能力。1D-CNN模型在验证集AUC为0.883，外部测试集AUC为0.880，显示良好稳定性。验证集准确率79.00%（正确识别76/100 IGN和82/100 IGP），外部测试集准确率90.00%，对IGN组特异性100.00%，对IGP组敏感性80.00%。对20个盲法样本的详细分析显示，高层级预测（如样本#1，概率99.94%，边际0.4182）提供了高置信度，而低层级样本（如样本#2）需谨慎解读。

**讨论与结论**
软件已公开发布于GitHub。当前局限性包括：样本多样性有限（如年龄、采集地点）、IGRA作为LTBI金标准的固有缺陷（无法区分活动性与LTBI，在低收入和中等收入国家[LMICs]应用受限）、GUI可升级为网页平台、以及需要适应更大数据集。未来工作将关注使用替代参考标准验证、纳入更多样化临床队列，并扩展平台至其他疾病检测。

研究人员开发了频谱分析软件平台TB-SERS Analyzer，该平台整合了ML和1D-CNN，并结合了源自人血浆的RS/SERS数据集。该工具具有用户友好的图形用户界面和简明的操作流程，旨在支持并简化结核病筛查过程。软件通过直观的点击运行界面支持单样本和批处理分析。数据处理完成后，诊断结果自动生成PDF格式报告。重要的是，该工具在分析来自不同RS/SERS数据集的数据时展现出一致性和可重复性。使用盲法样本的验证确认了该工具的适用性和诊断潜力。TB-SERS Analyzer代表了机器学习和深度学习技术在LTBI预测中的新应用，为传统诊断方法提供了一种快速、可及且可扩展的替代方案。论文发表在《PLOS Computational Biology》。