《International Journal of Biological Macromolecules》：DeepO-GlyThr: an interpretable deep learning framework for predicting O-linked threonine glycosites in human proteins
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Juanjuan Kang|Jiayao Li|Weiqi Liu|Min Shen|Yuwei Zhou|Xu Jia|Qiang Tang摘要O-连接糖基化是一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰，其发生位点深受局部序列环境的影响。苏氨酸是关键的受体残基，但目前用于预测人类O-连接苏
Juanjuan Kang|Jiayao Li|Weiqi Liu|Min Shen|Yuwei Zhou|Xu Jia|Qiang Tang
摘要 O-连接糖基化是一种普遍存在的蛋白质翻译后修饰，其发生位点深受局部序列环境的影响。苏氨酸是关键的受体残基，但目前用于预测人类O-连接苏氨酸糖基化位点的计算方法仍较为有限，且往往缺乏可解释性。在此，我们提出了DeepO-GlyThr，这是一种可用于预测人类蛋白质中O-连接苏氨酸糖基化位点的可解释深度学习框架。DeepO-GlyThr整合了序列特征，并运用卷积神经网络、双向门控循环单元以及注意力模块来学习具有区分性的模式。在独立测试集上，DeepO-GlyThr的敏感度为0.885，准确率为0.900，F1值为0.898，MCC值为0.800，这些性能均优于现有方法在默认分类阈值下的表现。可解释性分析表明，预测结果主要受中心苏氨酸周围局部物理化学环境及位置背景的影响，其中体积、疏水性、极性以及位置特征的作用最为显著。注意力分析、积分梯度分析以及突变分析进一步揭示了局部侧翼区域中与上下文相关的序列模式。总之，DeepO-GlyThr为预测O-连接苏氨酸糖基化位点提供了一个既准确又具备可解释性的框架。此外，我们还开发了一个用户友好的网络服务器以便人们使用该工具，访问地址为
http://i-health.info/DeepO-GlyThr 。
引言 蛋白质糖基化是最为常见且复杂的翻译后修饰之一[1]、[2]，它在蛋白质折叠、结构稳定性、细胞黏附、受体识别、免疫调节以及信号转导等方面发挥着重要作用[3]、[4]。越来越多的证据表明，异常的糖基化与肿瘤发生、炎症、自身免疫性疾病以及多种慢性疾病密切相关[5]、[6]。因此，糖基化研究已从结构表征扩展到功能调控、疾病机制研究以及临床应用领域[7]、[8]。此外，糖基化还会显著影响治疗性蛋白质的药效学、药代动力学以及稳定性[9]、[10]、[11]。
在各类糖基化类型中，由于结构多样性以及复杂的位点选择机制，O-连接糖基化在位点层面尤其难以确定[12]。与N-连接糖基化不同，O-连接糖基化通常不存在明确的共识序列模式[13]、[14]，其位点特异性更多依赖于局部序列环境，而非简单的模式识别[15]。尽管O-糖蛋白组学和质谱技术的进步提升了位点识别的水平，但在复杂的生物样本中对O-连接糖基化进行精确且大规模的特征分析仍然面临技术挑战[16]、[17]。
苏氨酸是O-连接糖基化过程中的重要受体残基。先前的研究表明，与苏氨酸相关的糖基化参与蛋白质功能调控、代谢重编程、肿瘤进展以及免疫逃逸过程[18]。最新的研究结果进一步表明，特异性的O-GlcNAcylation可直接调节蛋白质活性，并重塑肿瘤的免疫微环境[19]。这些发现凸显了在位点层面开展糖基化分析的重要性[20]。然而，与一般的O-连接糖基化研究相比，专门针对人类O-连接苏氨酸糖基化位点设计的计算方法仍然不够成熟，这限制了人们对序列决定因素及其背后机制的系统性探索。
由于实验方法成本高昂、通量低且耗时较长，基于序列的预测已成为一种重要的补充策略。人工智能方法在功能序列分析、药物发现以及生物医学数据挖掘等领域有着广泛的应用[21]、[22]、[23]、[24]、[25]、[26]，为从生物序列中学习复杂模式提供了强大的工具。这些进展也推动了用于识别蛋白质糖基化位点的计算方法的发展。NetOGlyc-4.0是一种用于预测丝氨酸和苏氨酸残基上黏蛋白型O-GalNAc糖基化位点的经典预测工具，但它并非专为预测苏氨酸位点而设计[27]。随后出现的O-GlyThr则在随机森林框架下，利用七种人工设计的序列编码来专注于预测人类O-连接苏氨酸糖基化位点[17]。尽管该模型效果不错，但由于它依赖预定义的特征以及传统的分类器，因此难以直接学习复杂的序列上下文。HOTGpred通过将预训练的蛋白质语言模型嵌入与传统的序列描述符相结合，再经过多阶段特征选择以及XGBoost分类，解决了这一局限性[28]。DOGpred则进一步整合了卷积神经网络以及基于注意力的BiGRU模块，并结合交叉注意力融合技术，从而捕捉到互补的局部和上下文序列特征[29]。DeepOTG则通过双分支架构拓展了这一思路，它将ESM-2衍生出的全局语义信息与PSSM提供的局部进化模式以及独热编码相结合[30]。尽管有了这些进展，许多现有方法仍依赖于多个高维描述符、预训练的嵌入向量或计算成本较高的进化特征谱，如何高效整合互补的序列信息依然是一个重要挑战。此外，一些新近开发的方法没有公开的网络服务器，这可能限制了它们的实际应用价值，尤其是对于那些缺乏相应资源或专业技能无法自行实现这些方法的用户而言。
除了计算效率与易用性之外，模型的可解释性也是另一个重要挑战。对于O-连接苏氨酸糖基化位点的预测而言，位点的识别取决于周围氨基酸、物理化学性质以及位置背景的协同作用。这些与上下文相关的特性使得深度学习非常适合用于学习复杂的序列模式[31]、[32]、[33]。然而，目前大多数研究主要关注预测性能，而对模型可解释性的研究相对较少。目前还不清楚是哪些位置和特征决定了模型的预测结果，以及序列扰动又会如何影响预测 outcome。因此，提升模型的可解释性对于理解O-连接苏氨酸糖基化的序列决定因素以及增强对计算预测结果的信心具有重要意义。
为了解决这些问题，我们提出了DeepO-GlyThr，这是一种可用于预测人类O-连接苏氨酸糖基化位点的可解释深度学习框架。该模型整合了氨基酸身份、物理化学性质以及位置特征，同时运用卷积神经网络、双向门控循环单元以及注意力机制来捕捉具有区分性的序列模式。除了关注预测性能外，我们还通过注意力分析、积分梯度分析以及计算机模拟突变分析，从多个角度解读模型的决策依据，包括位置重要性、特征贡献以及扰动响应等。通过将预测性能与多层次的可解释性相结合，DeepO-GlyThr不仅为糖基化位点的识别提供了计算框架，还为理解O-连接苏氨酸糖基化的序列决定因素带来了新的见解。为了方便用户使用，我们还在
http://i-health.info/DeepO-GlyThr 处搭建了在线服务器。该模型的源代码也已在
https://github.com/TangQiang0701/DeepO-GlyThr 公开发布。
章节节选 基准数据集 在本研究中，我们使用了之前在O-GlyThr研究中公布的人类O-连接苏氨酸糖基化位点数据集[17]。该数据集来源于那些拥有支持人类O-连接苏氨酸糖基化的蛋白质层面或转录本层面实验证据的UniProt条目。首先对这些蛋白质序列进行了冗余删除处理，然后通过一个长度为41个残基的滑动窗口提取候选片段，该窗口包括中心苏氨酸上游20个残基以及下游20个残基。那些具有实验
与现有方法的比较及表示学习分析 为了确保比较的公平性和可重复性，我们将DeepO-GlyThr与NetOGlyc-4.0、O-GlyThr以及HOTGpred进行了对比测试，这些方法的预测结果均可通过公开的网络服务器或现有的源代码获取。如图2A和表1所示，DeepO-GlyThr在独立测试集上的Sn、Acc、F1值以及MCC值均达到了最高水平，分别为0.885、0.900、0.898和0.800。这些结果表明，DeepO-GlyThr在识别正面的苏氨酸糖基化位点方面更具优势
讨论 在本研究中，我们开发了DeepO-GlyThr，这是一种可用于识别O-连接苏氨酸糖基化位点的可解释深度学习框架。在多项关键指标上，DeepO-GlyThr的表现均优于现有方法，尤其是Sn、F1值以及MCC值。这些结果表明，在默认决策阈值下，该模型能够更准确地识别出阳性糖基化位点，整体分类性能也更为优异。虽然AUC值和AUPRC值并非始终处于最高水平，但该模型在
CRediT作者贡献声明 Juanjuan Kang： 撰写——初稿撰写、方法设计、资金获取、正式分析、数据整理。Jiayao Li： 资源提供、数据整理。Weiqi Liu： 结果可视化、正式分析。Min Shen： 资源提供、数据整理。Yuwei Zhou： 结果验证、概念构思。Xu Jia： 撰写——审稿与编辑、研究指导、资金获取。Qiang Tang： 撰写——审稿与编辑、方法设计、资金获取、正式分析、数据整理。
关于写作过程中生成式人工智能及人工智能辅助技术的声明 在准备本研究的过程中，作者们使用了ChatGPT来提升手稿的语言表达清晰度与可读性。在使用该工具之后，作者们对内容进行了必要的审查和修改，并对最终发表文章的内容承担全部责任。
资助情况 本研究得到了国家自然科学基金委员会 （编号：62302066）、成都医学院科技计划 （编号：KYPY25-03）以及成都医学院优秀人才计划 （编号：2024kjTzn01）的支持。
