在纳米孔直接RNA测序与PCR-cDNA测序中，不同的5′和3′端覆盖偏好会影响转录组解读的结果

《BMC Genomics》：Distinct 5′ and 3′ coverage biases shape transcriptome interpretation in Nanopore direct RNA versus PCR-cDNA sequencing

　　

摘要

长读长RNA测序技术能够实现转录本的分型分析，但文库制备过程会引入系统性偏差，从而影响生物学结果的解读。我们以经白细胞介素-6刺激的SKMM2骨髓瘤细胞以及ERCC合成突变体为研究对象，对比了牛津纳米孔公司的两种测序方案——PCR-cDNA法和直接RNA法。直接RNA法生成的读长更长、质量更高，且能产生更多高可信度的转录本类型，但5′端的覆盖度明显较低。PCR-cDNA法则产生的片段较短，3′端序列表达不足，虽能检测到更多低丰度转录本，但其可信度较低。不同测序方案带来的偏差带来了显著影响：差异表达分析显示，对IL-6有响应的基因之间存在较少的重叠，而直接RNA法在通路富集分析方面的结果更为广泛。在转录本分型层面，不同转录本的表达差异几乎完全由所采用的测序方案决定，通过具体案例（如RPL22L1、GRB2、RNF220）可看出其一致性及差异性。ERCC对照实验进一步证实，这些偏差属于技术层面问题而非生物学因素所致。总体而言，我们的研究结果表明，尽管这两种方法都能实现准确的基因水平定量分析，但在转录本层面的结论则高度依赖于所选的测序方案，这凸显了在长读长转录组学研究中需谨慎选择测序方法的必要性。