靶向POLRMT驱动的Wnt/β-catenin表观遗传重塑以消除结直肠癌干细胞增殖

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Targeting POLRMT-driven epigenetic remodeling of Wnt/β-catenin to eradicate colorectal cancer stem cell proliferation

　　

结直肠癌干细胞（CSCs）通过尚不明确的代谢-表观遗传串扰驱动肿瘤进展。在此，研究人员鉴定出线粒体RNA聚合酶POLRMT是连接线粒体转录与CSC维持的关键环节。临床上，POLRMT在结直肠癌（CRC）组织中过表达，并与不良预后相关。POLRMT的基因敲除或药理学抑制可抑制细胞系来源的CSC、CRC类器官和异种移植模型中的CSC自我更新和致瘤性。机制上，POLRMT缺陷触发线粒体功能障碍，意外地升高了去甲基化酶KDM6B表达、α-酮戊二酸（α-KG）水平和Dickkopf-1（DKK1）表达，从而转录沉默Wnt/β-catenin信号并瓦解CSC生态位。恢复β-catenin可挽救POLRMT敲除（KO）细胞的致瘤性，证实了该信号级联的层级关系。关键的是，POLRMT的催化活性和线粒体定位对于维持这一轴心不可或缺。该研究揭示了POLRMT作为代谢门控因子，通过KDM6B–α-KG/H₃K₂₇me³介导的染色质重塑赋予CSC可塑性，提出将线粒体转录机器作为瓦解CRC中CSC层级的治疗靶点。

**研究背景、问题与研究目的**
结直肠癌（CRC）是全球第三大常见恶性肿瘤和癌症相关死亡的第二大原因，尽管手术、放化疗和免疫治疗改善了部分临床结局，但晚期转移和复发患者的5年生存率仍不足15%。癌症干细胞（CSCs）作为肿瘤中具有自我更新和分化潜能的稀有亚群，在肿瘤转移、耐药和复发中发挥核心作用；CSCs依赖氧化磷酸化（OXPHOS）供能，需持续线粒体生物合成。线粒体RNA聚合酶POLRMT是线粒体DNA（mtDNA）转录的唯一催化酶，维持OXPHOS机器组分的表达。已有研究表明POLRMT在多种肿瘤中过表达并与不良预后相关，但其在CSC维持中的功能及代谢-表观遗传串扰机制尚不明确。本研究旨在阐明POLRMT在CRC进展及CSC维持中的作用，揭示其调控线粒体功能障碍如何通过KDM6B-Wnt/β-catenin信号轴抑制CSC干性，并评估靶向POLRMT的治疗潜力。论文发表在《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》。

**主要关键技术方法**
研究人员使用以下关键技术：1) 单细胞转录组分析和CytoTRACE2计算工具，从公共scRNA-seq数据集中区分干细胞样CRC细胞并分析POLRMT表达偏好性；2) CRISPR/Cas9基因编辑技术构建POLRMT敲除（KO）CRC细胞系；3) 体内异种移植模型（裸鼠皮下成瘤及尾静脉肺转移实验）和有限稀释成瘤实验；4) Seahorse XF分析仪检测细胞氧气消耗率（OCR）和胞外酸化率（ECAR）；5) LC-MS靶向代谢组学测定细胞内代谢物变化；6) ChIP-qPCR检测组蛋白修饰及转录因子结合。样本队列来源包括TCGA-COAD数据库、96对CRC临床组织芯片（肿瘤与癌旁配对）及人CRC类器官。

**研究结果**

**POLRMT overexpression predicts colorectal cancer progression**
通过TCGA、TNMplot数据库及组织芯片免疫组化分析，发现POLRMT在CRC组织中显著过表达，且其高表达与较低的总生存期和更高的转移复发率相关。单细胞分析显示，POLRMT在具有更高干性评分的干细胞样CRC细胞中表达显著升高，且随着干细胞性梯度递增（从分化态到多能态）其表达比例和平均水平也逐步上升，Ro/e分析证实POLRMT+细胞富集于多能态细胞（Ro/e=1.27）。

**POLRMT depletion attenuates CRC stemness and malignant progression**
在HCT116和SW620细胞中敲除POLRMT后，细胞活力、集落形成和肿瘤球形成能力显著降低；干性标志物（CD44、CD133、LGR5、SOX2、β-catenin、Myc、CyclinD1）的mRNA和蛋白水平下调，而分化标志物（MUC2、KRT20、CDX2）上调。相反，POLRMT在HT29和HIEC细胞中过表达则增强肿瘤球形成和干性基因表达。在人类CRC类器官中，POLRMT敲低使类器官大小减小并下调LGR5、CD44、MYC、AXIN2表达。组织免疫荧光显示POLRMT高表达与LGR5共定位于原发和转移性CRC。体内异种移植实验证实POLRMT敲除显著抑制肿瘤生长、重量及肺转移结节形成；有限稀释实验显示POLRMT敲除组肿瘤起始频率（5×10³细胞时16.7%）显著低于对照组（83.3%）。

**Mitochondrial localization and catalytic activity dictate the oncogenic function of POLRMT**
POLRMT定位于线粒体；敲除后引起线粒体碎片化、嵴结构破坏、膜电位降低，mtDNA编码基因（MT-CO1、MT-CYB、MT-ND6）的转录和蛋白水平下降，而核编码线粒体蛋白（ATP5A、COXIV）不变。Seahorse分析显示POLRMT敲除降低最大呼吸能力并升高ECAR（代偿性糖酵解），而POLRMT重新表达完全恢复呼吸功能。RNA-seq证实POLRMT敲除显著抑制电子传递链复合物I、IV、V相关mtDNA基因转录。功能恢复实验表明，重新表达野生型POLRMT可完全挽救细胞增殖、迁移和干性；但缺失线粒体靶向信号（ΔMTS）或催化活性位点突变（D922A、Δ881-3）的变体均不能恢复上述表型及β-catenin/SOX2表达。

**POLRMT knockout suppresses tumorigenicity via a β-catenin-SOX2 axis**
RNA-seq的KEGG分析显示POLRMT敲除后Wnt/β-catenin信号通路显著富集。POLRMT敲除降低β-catenin/TCF转录活性（TOPFlash/FOPFlash实验），减少β-catenin核定位。使用WNT3A激动剂或过表达SOX2可恢复POLRMT敲除细胞的肿瘤球形成能力和β-catenin、Myc、CyclinD1表达。ChIP-qPCR证实POLRMT敲除后β-catenin在AXIN2启动子上的富集减少，而SOX2过表达可部分恢复。

**POLRMT ablation rewires α-KG metabolism to enforce H3K27me3/KDM6B-mediated epigenetic silencing**
代谢组学显示POLRMT敲除显著改变代谢谱，其中α-KG水平升高2-3倍。α-KG是KDM6B（H3K27me3去甲基化酶）的辅因子；POLRMT敲除导致全局H3K27me3水平降低，并上调KDM6B及其靶基因DKK1（Wnt/β-catenin拮抗剂）表达。外源补充dm-αKG模拟了POLRMT敲除的表型：抑制肿瘤球形成、降低H3K27me3及Wnt靶基因表达。ChIP-qPCR证明POLRMT敲除后DKK1启动子上H3K27me3富集减少，而KDM6B敲低可逆转该现象并恢复DKK1表达及肿瘤球形成能力。

**POLRMT inhibitor IMT1 eradicates colorectal CSCs**
POLRMT抑制剂IMT1（0.1-10 μM）以剂量依赖方式抑制SW620和HCT116细胞的肿瘤球形成，下调干性标志物mRNA和蛋白水平，同时上调DKK1。IMT1降低mtDNA编码基因表达和mtDNA含量，并提高细胞内α-KG水平1.7倍。

**POLRMT knockout inhibits intestinal crypt stemness**
在Polrmt^flox/floxVillin^cre（ΔIEC）小鼠中，POLRMT条件性敲除破坏小肠隐窝结构，降低LGR5等干性基因表达，上调DKK1，并减少LGR5免疫荧光信号。

**POLRMT regulates colorectal cancer stemness independently of nuclear RNA polymerase**
POLRMT敲除不影响核POLR家族其他亚基（如POLR3A、POLR3B）表达；单独沉默POLR3A或POLR3B不能抑制HCT116细胞的干性基因表达或肿瘤球形成能力，证明POLRMT通过线粒体特异性通路调控CRC干性。

**总结讨论部分**
研究人员在讨论中指出，CSCs对OXPHOS高度依赖，而POLRMT作为mtDNA转录的关键酶，其抑制可从根本上破坏线粒体代谢。该研究基于临床数据、scRNA-seq和功能实验首次将POLRMT鉴定为CRC的CSC靶点。机制上，POLRMT缺失导致线粒体功能障碍并引起α-KG积累，激活KDM6B，去除DKK1启动子上的抑制性H3K27me3标记，从而上调DKK1，抑制Wnt/β-catenin信号，瓦解CSC生态位。POLRMT的催化活性和线粒体定位对于该轴心至关重要。此外，POLRMT抑制剂IMT1验证了其抗CSC活性。研究结论翻译如下：
总之，本研究的发现强调了POLRMT在结直肠癌CSC自我更新中的关键作用。研究人员提供了证据表明POLRMT与CRC干性和恶性程度相关，POLRMT敲除在体外和体内均抑制肿瘤进展和自我更新能力。机制上，POLRMT缺失诱导代谢重编程并促进α-KG积累，进而调节KDM6B并诱导Wnt/β-catenin拮抗剂DKK1，从而降低β-catenin信号。此外，POLRMT抑制剂IMT1降低CRC细胞的自我更新能力。该数据提示靶向POLRMT可能提供一种针对CSC的有前景的治疗策略，有望克服治疗耐药并预防转移复发。然而，该研究也揭示POLRMT敲除不仅抑制CRC细胞干性，也抑制正常小肠隐窝细胞干性，提示靶向POLRMT的CRC治疗策略可能携带潜在风险。因此，未来研究应聚焦于实现肿瘤细胞特异性靶向POLRMT以降低治疗相关毒性。