靶向Gpx8-CSF1轴重塑肺肿瘤免疫微环境并克服抗PD-1治疗耐药

《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：Targeting of Gpx8-CSF1 axis resets the immune milieu of lung tumor and overcomes resistance to anti-PD-1 therapy

　　

尽管免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）具有应用前景，但仅有少数非小细胞肺癌（non-small-cell lung cancer, NSCLC）患者获得长期获益。在此项研究中，研究人员呈现了NSCLC的单细胞空间转录组景观，揭示了谷胱甘肽过氧化物酶8（glutathione peroxidase 8, Gpx8）表达升高与PD-1阻断耐药之间此前未被表征的联系。通过质谱流式细胞术（CyTOF）、可循环多重ed免疫荧光（CODEX）及ATAC测序（ATAC-sequencing）分析，研究人员证实在免疫健全及人源化小鼠模型中，Gpx8敲除抑制肿瘤生长。这种抑制伴随着抗肿瘤T淋巴细胞浸润增加、促肿瘤髓系细胞富集减少以及三级淋巴结构（tertiary lymphoid structures, TLS）的形成。在机制上，Gpx8通过其半胱氨酸79（cysteine 79）与Celf1（CUGBP Elav-like family member 1）的半胱氨酸177（cysteine 177）之间形成二硫键，抑制RNA结合蛋白Celf1的活性。该相互作用稳定CCAAT增强子结合蛋白β（CCAAT-enhancer-binding protein β, C/EBPβ）mRNA，促进集落刺激因子1（CSF1）分泌，并驱动髓系来源的抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells, MDSCs）向肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）的招募。值得注意的是，在表达Gpx8的NSCLC中对抗PD-1治疗的耐药性可通过强制表达Celf1、CSF1R阻断或设计用于破坏Gpx8-Celf1相互作用的模拟肽来克服。此外，抗PD-1或重组CSF1（rCSF1）处理激活C/EBPβ并上调Gpx8转录，建立了一个Gpx8-C/EBPβ-CSF1反馈环路，促进免疫逃逸。这些发现为Gpx8在调控肿瘤微环境中的作用提供了新见解，并为增强NSCLC对PD-1阻断治疗的敏感性提供了潜在框架。

该研究发表于《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》。非小细胞肺癌（NSCLC）约占肺癌病例的80%，是全球癌症相关死亡的主要原因。尽管以程序性死亡蛋白1（PD-1）、细胞毒性T淋巴细胞抗原4（CTLA-4）及PD-1配体（PD-L1）为靶点的免疫检查点抑制剂（ICIs）已作为一线或二线策略应用于NSCLC，但原发性耐药与继发性耐药率高仍是重大临床挑战，限制了长期疗效。肿瘤微环境（TME）内癌细胞与免疫细胞的交互复杂，其中髓系来源的抑制细胞（MDSCs）是关键免疫抑制成分，与肺癌患者生存率降低密切相关。谷胱甘肽过氧化物酶8（Gpx8）在癌组织中显著高于正常肺组织，其过表达与NSCLC不良预后相关，且能抑制凋亡、增强迁移侵袭，但其在塑造肿瘤免疫微环境中的角色尚不明晰。因此，研究人员开展此项研究，旨在揭示Gpx8在NSCLC免疫逃逸及对抗PD-1治疗耐药中的机制，探索克服耐药的新靶点与治疗框架。

为开展研究，研究人员主要运用了以下关键技术方法：对手术获取的肺腺癌（LUAD）组织进行10X Visium空间转录组测序分析；构建他莫昔芬诱导的Gpx8敲除及转基因KP（Kras^FSF-G12D/+; Trp53^frt/frt）基因工程小鼠模型与裸鼠模型；采用质谱流式细胞术（CyTOF）、可循环多重ed免疫荧光（CODEX）、ATAC测序（ATAC-seq）及批量RNA测序分析免疫微环境与染色质可及性；利用接近依赖性生物素化（BioID2） assay、原位邻近连接 assay（PLA）解析蛋白互作；开展体外Transwell迁移 assay、T细胞增殖抑制 assay及体内过继细胞转移（ACT）实验；设计并验证干扰Gpx8-Celf1相互作用的模拟肽（Pep-wt）并在同源及人源化小鼠模型中评估疗效；临床样本来源于上海交通大学附属胸科医院与武汉大学人民医院收集的NSCLC队列。

研究结果如下：

空间转录组学鉴定Gpx8为与抗PD-1治疗耐药相关的新候选基因。研究人员对接受抗PD-1治疗无应答与有应答的LUAD组织进行空间转录组分析，鉴定出9个细胞簇。比较应答与非应答病变中肿瘤细胞的差异基因表达谱，发现无应答组织中Gpx8表达显著升高，且Gpx8表达与干扰素刺激基因（ISG）评分呈负相关，表明Gpx8升高与炎性肿瘤微环境受抑及抗PD-1反应性降低相关。

Gpx8缺失抑制免疫健全小鼠肿瘤生长并促进肿瘤相关三级淋巴结构出现。研究人员在Gpx8^f/fKP小鼠中诱导Gpx8敲除，发现肿瘤负荷显著降低，生存期延长。免疫缺陷裸鼠中无此差异。对CD45⁺免疫细胞RNA测序显示Gpx8^-/-肿瘤中干扰素γ与TNF信号通路激活，且显著促进三级淋巴结构（TLS）发育，提示Gpx8缺失重塑为T细胞驱动的炎性微环境。

Gpx8通过MDSCs介导的CD8⁺T细胞功能耗竭促进肿瘤生长。CyTOF分析显示Gpx8^-/-小鼠TME中单核（M）-MDSCs、多形核（PMN）-MDSCs及肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）减少，抗肿瘤T淋巴细胞增加。Gpx8^-/-组中TIM-3⁺、PD-1⁺耗竭TILs减少，TNFα与IFN-γ水平升高。过继转移MDSCs而非中性粒细胞可逆转Gpx8敲低对LLC1肿瘤的抑制，且Gpx8^+/+背景下耗竭Gr1⁺髓系细胞亦能抑制肿瘤，证实MDSCs聚集是Gpx8促瘤的关键。

Gpx8敲低通过降低CSF1介导的MDSCs招募抑制肺肿瘤生长。RNA测序与qRT-PCR筛选发现CSF1在Gpx8敲除组织中分泌减少。体外共培养显示Gpx8缺陷降低MDSCs对T细胞扩增的抑制，重组CSF1（rCSF1）可恢复该抑制及MDSCs招募。体内Gpx8转基因（Tg）小鼠肿瘤加重，CSF1R抑制剂PLX3397可逆转此表型并减少MDSCs、增加T细胞。临床数据中Gpx8与CSF1高表达伴T细胞特征评分降低相关。

Gpx8通过激活C/EBPβ促进CSF1分泌。ATAC-seq显示Gpx8^-/-细胞中C/EBPβ启动子区染色质开放性降低。整合ATAC-seq与RNA-seq发现C/EBPβ是Gpx8^-/-中下调最显著的转录因子，已知其激活CSF1转录。在Gpx8敲低的LLC1中过表达C/EBPβ可恢复CSF1分泌、增加MDSCs并减少CD8⁺T细胞，证实Gpx8经C/EBPβ介导CSF1分泌。

Gpx8通过二硫键抑制Celf1活性上调C/EBPβ mRNA水平。BioID2鉴定到RNA结合蛋白Celf1为Gpx8互作蛋白。原位PLA证实GPX8 C79与Celf1 C177间二硫键介导互作，GPX8-C79S突变体消除互作并降低C/EBPβ mRNA及蛋白水平。人源化小鼠中表达GPX8-C79S抑制肿瘤生长、减少人MDSCs（HLA^-DR^-CD11b⁺CD33⁺）并增加TILs。

破坏GPX8/CELF1复合物的模拟肽克服MDSC介导的T细胞功能障碍并增强抗PD-1疗效。设计的含C79的模拟肽（Pep-wt）可破坏GPX8/CELF1共定位，延迟Gpx8过表达LLC1肿瘤生长，降低MDSCs抑制、增加活化CD8⁺TILs（CD69⁺CD44⁺）及细胞毒性基因表达，且在Rag1^-/-小鼠中无效。Pep与抗PD-1或过继细胞转移（ACT）联用优于单药，协同抑制肿瘤并提升IFNγ⁺T细胞频率。

CODEX分析证明模拟肽对Gpx8失调肺肿瘤的作用。34抗体CODEX面板分析显示，模拟肽处理组肿瘤细胞数下调、免疫细胞浸润上调，TME中细胞类型分布改变，细胞毒性TILs积累增加，CD11b⁺Ly6G⁺MDSCs与巨噬细胞减少，证实肽治疗重塑Gpx8失调肺肿瘤TME。

CSF1或抗PD-1处理反过来激活C/EBPβ促进Gpx8转录，建立Gpx8-C/EBPβ-CSF1反馈环路。研究发现CSF1与抗PD-1处理均上调C/EBPβ及Gpx8，C/EBPβ缺失（C/EBPβ^-/-）后CSF1无法诱导Gpx8，ChIP证实C/EBPβ结合Gpx8启动子。TCGA中GPX8在LUAD高表达且预后差，与C/EBPβ、CSF1正相关，伴高MDSC特征与低T细胞反应，证实该反馈环路是肺肿瘤免疫负调控关键。

讨论部分总结：既往已知Gpx8在多肿瘤中有促癌效应，但其对免疫微环境的调控不清。本研究阐明Gpx8敲除清除促癌髓系细胞、解除MDSC介导的免疫抑制、激活TILs阻滞肺癌进展，揭示Gpx8对MDSCs的双重影响。靶向Gpx8重编程微环境可使“冷”肿瘤转“热”，增敏抗PD-1，GPX8水平或与胶质瘤PD-1抑制剂反应相关。EGFR突变NSCLC对ICIs响应有限，本研究提示Gpx8-CSF1轴或是跨分子亚型的共有髓系主导免疫抑制机制，GPX8或可成为识别免疫冷肿瘤的生物标志物。治疗性肽具合成易、低毒、高特异优势，靶向Gpx8-Celf1互作较全局靶向Celf1更安全，因Gpx8在恶性肿瘤过表达。但肽类存血清蛋白酶降解、半衰期短、生物利用度低及全身分布非特异等局限，需化学稳定、靶向递送或小分子优化方可临床转化，目前开展NSCLC患者模拟肽临床试验尚早。

研究结论翻译：Gpx8通过增强MDSCs在TME内的招募及免疫抑制功能促进NSCLC免疫逃逸。机制上，Gpx8与RNA结合蛋白Celf1形成二硫键，从而稳定C/EBPβ mRNA并促进CSF1分泌，驱动MDSC聚集并抑制抗肿瘤T细胞反应。此外，研究人员开发了破坏Gpx8-Celf1相互作用的竞争模拟肽，可恢复免疫激活并与免疫检查点阻断协同抑制肿瘤生长。这些发现定义了此前未认识的调控NSCLC免疫抑制的Gpx8-C/EBPβ-CSF1信号轴，并通过双重靶向Gpx8与免疫检查点为提升疗效提供了新策略。

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