《Drug Delivery and Translational Research》：E-selectin and transferrin receptor functionalized synthetic miRNA nanoshuttles with therapeutic potential in stroke
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目前的急性缺血性卒中治疗仅限于发病后最初数小时内的再灌注疗法，凸显了迫切需要新型治疗策略以减轻脑损伤进展。在此，研究人员描述了一种受生物启发的合成纳米穿梭体——脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）的开发，其设计用于递送miRNA并
目前的急性缺血性卒中治疗仅限于发病后最初数小时内的再灌注疗法，凸显了迫切需要新型治疗策略以减轻脑损伤进展。在此，研究人员描述了一种受生物启发的合成纳米穿梭体——脂质纳米颗粒（lipid nanoparticles, LNPs）的开发，其设计用于递送miRNA并靶向卒中后炎症这一继发性脑损伤的关键促成因素。从人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）中分离的miRNA通过微流控技术封装入LNPs。研究人员制备了尺寸小、均匀的纳米颗粒，具有高的miRNA封装效率。LNPs经抗转铁蛋白受体（anti-transferrin receptor, TfR）和抗E-selectin抗体功能化以靶向发炎的脑血管系统。研究人员在体外血管炎症模型及小鼠脑缺血/再灌注后的体内模型中评估了LNPs的效应。在培养的人脑微血管内皮细胞中，空载LNPs、双靶向空载LNPs及封装了miRNA的双靶向LNPs（dual-targeted LNP, DT-LNP）降低了脂多糖诱导的白介素-6（interleukin-6, IL-6）产生，表明在所述实验条件下脂质载体具有调节作用。小鼠在脑缺血后再灌注时通过静脉注射接受空载LNPs（对照）或两种不同剂量的DT-LNPs。低剂量DT-LNPs减少了梗死体积，有改善神经功能缺损的趋势，并下调了IL-1β和E-selectin mRNA的表达，而高剂量则无此效应。总之，这些发现提供了概念验证，表明包裹hiPSC衍生miRNA的TfR-E-selectin靶向LNPs代表了一种有前景的卒中治疗方法。
研究背景与意义
当前的急性缺血性卒中治疗主要局限于发病早期窗口内的再灌注疗法，对于随后发生的继发性脑损伤缺乏有效的干预手段，而卒中后炎症反应是加剧脑损伤的核心环节。因此，开发能够靶向炎症、穿越血脑屏障（blood-brain barrier, BBB）的新型治疗策略具有重要临床转化价值。该研究发表于《Drug Delivery and Translational Research》，研究人员基于此背景，设计并构建了双靶向脂质纳米颗粒（dual-targeted lipid nanoparticles, DT-LNPs），旨在利用抗E-selectin抗体识别缺血后上调的血管内皮炎症位点，同时利用抗转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR）抗体介导跨BBB转运，封装人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells, hiPSCs）来源的miRNA混合物以模拟内源性神经保护信号。研究通过体外细胞模型与小鼠大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAo）再灌注模型，验证了该纳米穿梭体在调节炎症及减小梗死体积方面的概念验证疗效，为卒中治疗提供了兼具靶向性与生物活性的新型递送平台。
主要关键技术方法
研究人员采用微流控混合技术制备基于DLin-MC3-DMA离子izable lipid的LNPs，通过优化N/P比（氮磷比，氮原子与寡核苷酸磷原子的比率）实现miRNA高效封装。利用后插入法（post-insertion method）将硫醇化抗E-selectin与抗TfR抗体共价偶联至含PEG-MAL的LNP表面以实现双靶向功能化。物理化学表征包括动态光散射（dynamic light scattering, DLS）测粒径与多分散指数（polydispersity index, PDI）、Zeta电位及钙黄绿素（calcein）滞留实验评估血清稳定性。体外研究使用人脑微血管内皮细胞（hBMVEC）与hCMEC/D3细胞系，建立脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）炎症模型评估摄取、跨内皮转运（Transwell）及细胞因子表达（qRT-PCR、ELISA）。体内研究采用12周龄雄性C57BL/6j小鼠（n=30），建立45分钟短暂性MCAo再灌注模型，再灌注10分钟后颈静脉给药，24小时后通过7T MRI测梗死体积、评估神经功能缺损评分及脑组织炎症基因表达。
研究结果
Formulation of (mono & dually) targeted LNPs
研究人员通过初步优化确定N/P比为8可实现miRNA完全封装（封装效率约100%），提高至N/P=30可进一步降低粒径与PDI，形成更致密均一的LNPs。双靶向修饰后抗体附着率约80%，粒径略有增加但保持物理稳定性，miRNA cargo的存在增强了LNPs在4℃储存50天及胎牛血清（Fetal Calf Serum, FCS）中的结构完整性。
Cellular model studies
空载LNPs在低于1.32 mg/ml浓度下对HEK293、hCMEC/D3及B16细胞无明显毒性。在hCMEC/D3炎症模型中，双靶向LNPs的细胞摄取较非靶向组在炎症状态下提升约61.2倍，且可被游离E-selectin与转铁蛋白阻断，证实通过抗体-受体相互作用介导靶向。在hBMVEC单层BBB模型中，双靶向LNPs的跨内皮转运效率较非靶向组提升约3.5倍（亲水标记FAM）与5.4倍（疏水标记RHO），RHO/FAM转运比接近1，表明完整囊泡跨膜转运，且未破坏单层紧密连接（Lucifer Yellow通透性无变化）。
Effect of LNPs in a model of inflammation in hBMVEC
LPS刺激显著上调hBMVEC的IL6、IL1B、TNF及SELE表达。空载LNPs、双靶向空载LNPs及DT-LNPs均能显著降低IL6 mRNA及分泌蛋白水平，空载组亦下调IL1B与ANGPT2表达，表明脂质载体本身在特定条件下具有炎症调节作用，加入miRNA未表现出额外显著增益但该部分在体内呈现剂量依赖性差异。
Effect of LNPs in an vivo model of ischemia in mouse
体内实验中，低剂量DT-LNPs（脂质2.5 mg/ml，miRNA 2.15 μg/鼠）显著减少梗死体积（vs对照组p=0.0287），改善水肿与体重丢失趋势及神经评分，并下调脑组织中Il1b、Sele等炎症相关mRNA趋势；高剂量（5 mg/ml）则无此保护效应，提示存在治疗窗口与剂量依赖性免疫激活风险。
讨论与结论翻译
在讨论中，研究人员指出，本研究开发了携带hiPSC来源miRNA并经抗E-selectin与TfR抗体功能化的人工纳米穿梭体，以特异性靶向发炎的内皮细胞，并考察其在血管炎症与脑缺血模型中的抗炎与神经保护作用。将miRNA纳入离子izable LNPs可抑制病毒载体引发的免疫反应，DLin-MC3-DMA在生理pH下近中性具备良好耐受性。双靶向策略协同增强内皮结合与转运，但空载体亦显示部分抗炎调制，提示需区分各组分贡献。低剂量有效而高剂量失效与离子izable LNPs高剂量促炎报道一致。研究局限性包括缺乏体内生物分布直接证据、静态单层模型未模拟血流剪切力及神经血管单元复杂性、未设非靶向miRNA-LNP及乱序miRNA对照、仅用雄性小鼠等。结论部分表明：研究人员制备了具备以下特性的LNPs：（i）适用于体内给药的生物相容性脂质组成；（ii）内源性人miRNA的高封装率（100%）并增强纳米颗粒稳定性；（iii）整合抗E-selectin与抗TfR抗体以增加体外内皮结合与转运；（iv）在卒中模型再灌注时单次给予双靶向miRNA负载纳米穿梭体可减少梗死体积并调节炎症标志物。总体而言，研究发现为将TfR与E-selectin双靶向与离子izable LNPs递送复杂hiPSC衍生miRNA相结合提供了概念验证，支持进一步开发该纳米穿梭体平台作为调节血管炎症与改善缺血性卒中预后的潜在策略。
