UV暴露期间的表观遗传重塑：DNA结合蛋白2突变模型中组蛋白翻译后修饰的高分辨率分析

《Histochemistry and Cell Biology》：Epigenetic remodeling during UV exposure: high resolution analysis of histone post-translational modifications in a DNA binding protein 2 mutant model

　　

染色质包含真核生物的遗传信息。多种表观遗传机制，如DNA的化学修饰和组蛋白翻译后修饰(PTMs)，调控染色质组织和结构，影响RNA转录，并从同一基因组驱动不同的基因表达模式。这种表观遗传控制高度动态，并受到各种事件的影响，例如导致基因表达改变的DNA损伤，从而驱动衰老、神经退行性疾病和癌症。然而，这种相互作用仍知之甚少，识别新的分子效应物可能为治疗目的提供线索。在此，研究人员研究了UV暴露对表达损伤特异性DNA结合蛋白2(DDB2)突变形式的细胞的影响，DDB2是UV损伤修复的关键蛋白，其与增殖细胞核抗原(PCNA)的相互作用被破坏，从而损害了DDB2的正常降解。研究数据表明，突变DDB2的过表达导致UV照射后持续的表观遗传改变，表现为H3K9乙酰化(H3K9ac)和三甲基化(H3K9me3)检测水平升高，以及5-甲基胞嘧啶(5mC)增加和γ-H2AX的亚核定位改变。总之，这些发现表明DDB2–PCNA相互作用不仅调节DDB2稳定性，而且调节基因组的表观遗传景观。

真核生物染色质将遗传信息包装成高度有序的结构，受DNA化学修饰和组蛋白翻译后修饰(PTMs)等表观遗传机制调控，影响基因转录并驱动同一基因组产生多样表达模式。这种调控高度动态，易受DNA损伤等事件干扰，导致衰老、神经退行性疾病和癌症相关基因表达改变。然而，UV暴露如何重塑细胞表观基因组以及哪些蛋白参与这一过程仍不清楚。基于此，研究人员利用HEK293细胞（人胚肾细胞系，购自ECACC）表达损伤特异性DNA结合蛋白2(DDB2)的突变体(DDB2^PCNA?)，该突变体因PIP-box序列突变无法与增殖细胞核抗原(PCNA)结合，从而破坏DDB2正常降解。通过UV-C照射（10 J/m²，254 nm）诱导DNA损伤，研究人员采用透射电子显微镜(TEM)免疫金标记技术检测p300、H3K9乙酰化(H3K9ac)、H3K9三甲基化(H3K9me3)、5-甲基胞嘧啶(5mC)及γ-H2AX的核丰度与亚定位；结合EDTA回归染色区分异染色质、锇氨染色评估染色质压缩状态，以及Western blot（检测H3K9me3和DDB2）和流式细胞术（分析γ-H2AX与细胞周期），系统解析了DDB2–PCNA相互作用对UV后表观遗传景观的影响。研究发现，DDB2–PCNA相互作用缺失导致持续的表观遗传重塑，具体表现为组蛋白乙酰化与甲基化同时异常升高、DNA甲基化增加，以及γ-H2AX信号减弱和定位改变，提示该相互作用不仅调控DDB2稳定性，还参与UV损伤后表观基因组的修复与重置。这些成果于《Histochemistry and Cell Biology》发表，为理解DDB2在UV损伤应答中的表观调控机制提供了新视角。

**UV暴露后DDB2^PCNA?细胞中p300和H3K9乙酰化增加**：通过EM免疫金标记发现，DDB2^PCNA?细胞在UV照射后3天和7天，乙酰转移酶p300的核丰度均显著升高，而对照和DDB2^Wt过表达细胞无显著变化。同时，H3K9ac的免疫金标记显示相同的增强模式，且主要定位于常染色质和围染色质区，与p300分布一致。这表明DDB2–PCNA相互作用破坏导致组蛋白乙酰化状态的持续激活。

**DDB2^PCNA?与DDB2^Wt细胞中组蛋白甲基化的不同时间响应**：Western blot和EM免疫金标记分析H3K9me3发现，DDB2^PCNA?细胞在UV后3天即出现显著升高，并持续至7天，增幅约4倍；而DDB2^Wt细胞仅在3天短暂升高，7天恢复至基线。这表明功能性DDB2–PCNA相互作用对H3K9三甲基化的时间调控至关重要，其缺失导致甲基化水平无法复位。

**DNA与组蛋白甲基化显示相似的时间依赖性过程**：EM免疫金标记5mC的结果与H3K9me3高度平行。DDB2^PCNA?细胞在UV后3天和7天5mC水平持续升高，而DDB2^Wt细胞同样呈现先升后降的波动模式。这种协同性提示DNA甲基化与组蛋白H3K9三甲基化在UV损伤应答中紧密关联，且依赖于DDB2–PCNA的完整功能。

**DNA损伤、染色质组织与磷酸化组蛋白H2AX**：流式细胞术检测γ-H2AX显示，UV后72小时，DDB2^PCNA?细胞的γ-H2AX水平显著低于照射的对照细胞，且与非照射组无差异；而对照与DDB2^Wt细胞则显著升高。EM免疫金标记进一步揭示，DDB2^PCNA?细胞中的γ-H2AX主要富集于常染色质和围染色质区，而对照与DDB2^Wt细胞呈弥散分布。锇氨染色显示，DDB2^Wt和DDB2^PCNA?过表达细胞在UV后72小时染色质压缩程度均增加，但γ-H2AX的差异定位表明DDB2–PCNA相互作用影响DNA损伤信号的有效解析。

**UV暴露对对照与突变细胞的一般效应**：通过时间点比较，DDB2^PCNA?细胞中p300和H3K9ac在UV后显著上升，而对照与DDB2^Wt细胞则下降或无变化；H3K9me3和5mC在DDB2^PCNA?中持续升高，而对照细胞中5mC减少；γ-H2AX在DDB2^PCNA?中维持基础水平，对照与DDB2^Wt中则升高。这些结果进一步证实DDB2–PCNA相互作用缺失导致UV后表观基因组无法恢复至照射前状态。

讨论部分指出，DDB2–PCNA相互作用不仅具有结构稳定性功能，更深刻参与UV损伤后表观基因组重塑。其缺失导致H3K9ac和H3K9me3同时增加，呈现染色质状态的重组而非单向激活或抑制。γ-H2AX水平降低及其在常染色质区域的异常滞留，可能与上皮间质转化(EMT)相关，提供增殖优势。研究结论可翻译为：总之，这些发现表明DDB2–PCNA相互作用不仅调节DDB2的稳定性，而且调节基因组的表观遗传景观。