综述：肽类药物质量评估的监管和分析考虑

《Journal of Pharmaceutical Investigation》：Regulatory and analytical considerations for the quality assessment of peptide drugs

　　

摘要
背景
肽类药物（peptide drugs）在分子大小和结构复杂性方面处于小分子药物（small-molecule drugs）和生物制剂（biologics）之间的中间位置。由于其独特特性，它们在质量评估和控制方面面临监管挑战，因为现有的针对小分子和生物制剂的监管框架不完全适用于肽类药物。为了应对这些挑战，监管机构和药典机构基于科学考虑制定了指南和分析标准，以确保制造一致性和可靠的质量评价。

涵盖范围
本综述通过分析主要监管机构和药典发布的指南和标准，探讨了肽类药物的近期监管趋势，重点关注鉴定、杂质检测和含量测定的分析策略。肽固有的复杂性需要全面且正交的分析方法来准确表征其结构属性并满足严格的监管要求。在此背景下，先进分析技术如质谱（MS）和核磁共振（NMR）光谱在肽质量评估中发挥互补作用。MS是用于序列分析和杂质谱分析的高灵敏度工具，而NMR在结构解析、高阶结构（higher-order structural）评估和正交确认方面提供独特能力。

专家意见
最近分析技术的进步显著促进了基于科学的合成肽类药物监管策略的发展。肽类药物法规的持续协调，结合先进分析方法和工业视角的整合，有望促进高效的质量评估并支持安全有效的肽类治疗药物的生产。

肽类药物的监管定义：肽是由氨基酸（AAs）组成的聚合物，与蛋白质相似但尺寸较小。监管机构间缺乏一致定义：美国食品药品监督管理局（FDA）将≤40个氨基酸的α-氨基酸聚合物定义为肽；欧洲药品质量与健康管理局（EDQM）规定合成肽分子量通常低于5000 Da；欧洲药品管理局（EMA）指出四肽及更小分子可能被视为小分子药物。这些差异凸显了国际协调的必要性。

科学监管框架的必要性：肽类药物因结构复杂性和制剂多样性无法完全通过常规理化分析表征，制造一致性和治疗等效性验证面临挑战，被视为复杂药物。目前美国药典-国家处方集（USP-NF）和欧洲药典（Ph. Eur.）仅收录约20种肽类药物，多数为化学合成产品。

肽类药物制造：现代生产主要通过重组DNA（rDNA）技术和化学合成两条路径。rDNA技术适用于长序列肽，但无法引入非天然氨基酸修饰；化学合成（液相肽合成LPPS和固相肽合成SPPS）可自动化放大，SPPS能合成超过20个氨基酸的肽链，但杂质谱更复杂。

肽类药物监管指南：FDA于2021年发布指南，允许合成肽药物产品通过简化新药申请（ANDA）途径参照rDNA来源的参照上市药品（RLD），需通过全面理化表征（包括一级序列、二级结构、寡聚/聚集状态）和生物评价证明活性成分相同。USP-NF发布通用章节<1503>和<1504>，分别规定合成肽原料药（DS）质量属性和起始材料最低质量要求。欧洲EDQM发布合成肽专论制定技术指南，规定至少使用两种互补方法进行鉴定。EMA于2025年最终确定合成肽指南，涵盖制造过程、表征、规格和分析控制。

鉴定测试：监管框架要求使用至少两种正交技术。USP-NF、EMA和EDQM推荐的方法包括高效液相色谱（HPLC）与参比标准（RS）共洗脱、质谱（MS）、氨基酸分析（AAA）、串联质谱（MS/MS）测序、核磁共振（NMR）光谱、肽图、对映体纯度评估、N-末端序列分析、红外（IR）光谱、高阶结构（HOS）分析和生物活性检测。

质谱（MS）：MS已成为肽分析的关键工具。基质辅助激光解吸电离（MALDI）和电喷雾电离（ESI）是常用软电离技术。ESI特别适合与液相色谱（LC）联用。质量分析器包括飞行时间（TOF）、四极杆和离子阱系统，高分辨质谱（HRMS）推荐用于分子量>2 kDa的肽。同位素分布影响质量计算，单同位素质量用于短肽，平均质量用于长肽。

肽图：基于一级结构分析的鉴定方法，推荐用于序列>20个氨基酸的肽。通过与RS的肽图比较验证结构一致性。方法开发需选择适当的消化酶（如胰蛋白酶、Glu-C、胰凝乳蛋白酶）和分离技术（通常为反相HPLC），并通过MS辅助确认片段。

氨基酸分析（AAA）：经典鉴定技术，酸水解后色谱分离，评估氨基酸组成和相对比例。可区分亮氨酸（Leu）和异亮氨酸（Ile），但无法区分天冬酰胺（Asn）/天冬氨酸（Asp）和谷氨酰胺（Gln）/谷氨酸（Glu），结果易受分析条件影响。NMR可作为AAA的互补工具。

核磁共振（NMR）光谱：基于磁核对特定射频辐射吸收的结构鉴定技术。通过化学位移（δ）、多重性、自旋-自旋耦合常数（J）和相对信号强度提供结构信息。适用于短肽（约≤15个氨基酸），推荐1D和2D技术（如¹H-¹³C HSQC、¹H-¹H COSY）。鉴定通过谱图比较进行，定性参数（化学位移±0.1 ppm、多重性、J）和定量参数应一致。

杂质测试：杂质控制是关键质量属性（CQA），分为肽相关杂质（结构与活性药物成分相似）和非肽相关杂质（残留溶剂、元素杂质等）。肽相关杂质来源包括起始材料、制造过程和降解（脱酰胺、消旋、氧化、水解）。非肽相关杂质中，三氟乙酸（TFA）作为残留工艺杂质需控制。可接受标准：Ph. Eur.规定报告限0.1%、鉴定限0.5%、质控限1.0%；FDA按个案评估。

含量测定与肽含量：含量测定通常采用HPLC相对方法，结果以无水、无抗衡离子计。肽含量（净肽含量）通过质量平衡法计算，使用绝对方法（定量AAA、氮分析、紫外（UV）光谱、定量NMR（qNMR））测定。qNMR特别适用于缺乏UV发色团的肽和聚集评估，但需合适内标。

先进分析技术的应用——MS：MS在肽质量评估中应用广泛，包括完整质量分析、肽图测序（结合C¹³等同位素标记）、MS/MS测序（碰撞诱导解离产生b离子和y离子）鉴定修饰位点。LC-MS用于杂质筛查和定量，可检测共洗脱杂质并提供精确质量信息。

先进分析技术的应用——NMR：NMR用于氨基酸序列确认和高阶结构（HOS）评估。通过1D和2D技术（如¹H-¹H COSY、¹H-¹³C HSQC）实现结构归属。评估HOS时，推荐1D ¹H、2D ¹-¹³C、¹-¹⁵N以及扩散排序光谱（DOSY），并设定马氏距离（D_M）和化学位移差（Δδ）标准。qNMR可用于API、抗衡离子和杂质定量，如使用¹H-NMR定量八肽醋酸奥曲肽，¹⁹F-NMR定量TFA。

讨论与未来展望：现有监管框架未完全覆盖合成肽类药物，需制定定制策略。MS和NMR在质量评估中发挥互补作用：MS适用于不同长度肽的一级结构分析和杂质鉴定，灵敏度高；NMR适用于短肽结构解析、HOS评估和正交确认，但杂质定量能力有限。工业调查显示HPLC是最常用技术，MS第二常用，肽图用于长序列肽，NMR常用于结构表征而非常规鉴定。寡聚体作为HOS的重要方面，USP-NF和EMA定义略有差异。未来需整合先进技术和工业见解，采用阶段适宜或个案方法建立协调的监管框架。

结论：肽类药物因其介于小分子和生物制剂之间的特性需专门监管框架。通过分析FDA、EMA、EDQM和药典标准，强调了鉴定、杂质和含量等CQA的稳健分析策略。MS和NMR互补，结合常规方法可实现全面质量评估。当前指南仍碎片化，需通过整合先进技术和工业实践建立基于科学的协调框架，支持肽类药物开发和质量保证。