综述：在肺的三维背景下定位细胞特异性改变的方法

《Frontiers in Physiology》：Methods to localize cell specific alterations within the 3D context of the lung

　　

肺是一个异质性器官，由形态学上不同的亚区室（sub-compartments）组成。在分析肺部病理时，收集病变的空间位置（spatial location）至关重要，以便将临床前研究结果转化到人类肺，或制定靶向治疗策略。本综述以支气管肺发育不良（bronchopulmonary dysplasia，BPD）为研究肺部病理的示例，但所展示的方法也可适用于其他病理。综述重点在于常见的组织学方法（histological methods），以及将其用于研究细胞特征（cellular features）和位置评估（location assessment）的潜力。研究人员将考虑形态学特征以及细胞周期（cell cycle）和细胞死亡（cell death）相关的细胞内状态。在高级部分，详细描述了将多种成像方法组合成分析流程（analysis pipelines）的方法，包括不同的组合可能性及其优势和研究背景下的应用。通过将显微镜（microscopy）和计算机断层扫描（computed tomography）整合到一个流程中，可以评估3D位置和细胞特征，并可选使用免疫组织化学标记物（immunohistochemical markers）检测特定蛋白质。这是一个可用于解决肺部病理相关的过渡性（transitional）和纵向性（longitudinal）研究问题的工具。

1 引言
哺乳动物的肺具有高度异质性的结构。气道形成树状分支结构，从气管向下延伸至肺泡。在此过程中，气道整体尺寸、细胞组成和气道上皮维度，以及平滑肌细胞层数和腺体或支撑软骨的存在均发生变化。终末细支气管标志着从优化气流的空气传导系统向优化气体弥散的区室转变。血管系统也存在类似多样化结构，其中中央肺动脉和包绕肺泡的毛细血管在尺寸和组成上差异巨大（Weibel，2009）。这种多面性器官组成导致不同形态功能组成的亚区室对外部应激源的易感性、损伤后果和病变表现存在差异。因此，在肺部疾病的临床前动物模型中，确定观察到的变化的位置至关重要，这既有助于促进治疗组和对照组之间的适当比较，也有助于将结果转化到人类肺。本文将以支气管肺发育不良（BPD）作为肺损伤来源，但所列方法也适用于其他肺部病理。BPD是一种影响极早产儿（<28周胎龄）的综合征，此时肺仍处于发育早期阶段，特别是小管期或早期囊泡期。机械通气和高氧等必要治疗会导致肺损伤，可能引发肺泡化和微血管发育的中断（Thebaud et al.，2019）。在器官水平上，受影响的肺可能呈现大气道阻塞和小气道过度充气（Bush et al.，2023）、肺泡增大和简化（Coalson，2003），以及肺血管简化或生长停滞（Abman，2008）等特征。在细胞水平上，气道可表现出上皮增厚（Tiddens et al.，2008）、纤毛异常（Lee and O'Brodovich，1988）或杯状细胞和平滑肌细胞数量增加（Hislop and Haworth，1989）等形态改变。血管中平滑肌细胞增殖也是一个问题，可导致肺动脉高压（Hansmann et al.，2020）。这些变化的主要驱动因素是氧化应激，未成熟肺对此尤为敏感，最终导致炎症和程序性细胞死亡（Kaarteenaho-Wiik and Kinnula，2004；Wang and Dong，2018）。早产儿的抗氧化酶系统尚不发达。高氧会增加线粒体中活性氧（reactive oxygen species，ROS）的产生，进而导致细胞内积累，引起应激和损伤，最终可能以凋亡告终（Deng et al.，2022）。ROS积累还可刺激黏液分泌增加和肺血管收缩（Barnes，1990；Wright et al.，1994）。这些变化在肺内分布不均。在高氧小鼠模型中，肿瘤抑制基因p53的免疫组织化学检测显示其在远端支气管上皮细胞以及肺泡上皮中积累（程度较轻）。这表明局部出现氧化应激反应高峰，形式为DNA损伤和随后的细胞周期停滞，可能导致细胞衰老或凋亡（O'Reilly et al.，1998）。在BPD兔模型中对肺血管（Labode et al.，2023）和气道（Pfleger et al.，2025）的形态学研究也显示实验组和对照组之间的差异呈异质性分布。受影响部位可归因于特定气道分支水平，显示出一种多样化的病理，这种病理难以仅使用全局方法（即不记录或考虑所采样结构的位置）捕获。本综述旨在介绍识别肺中细胞改变的不同方法，以及这些方法在器官构架内提供感兴趣位点空间背景的能力。研究人员将进一步介绍一种多步骤成像方法的新扩展，该方法最初由Grothausmann等人（2021）建立，展示了细胞内物质水平基于位置评估的可能性。所讨论的方法针对临床前小动物模型。应用于人类肺病理需要对所呈现的工作流程进行修改。

2 光镜
2.1 组织学切片
通过光镜（light microscope，LM）对肺组织学切片进行形态学研究是肺研究的核心方法（参见Weibel，1963；Ochs and Muhlfeld，2013）。该方法所需昂贵设备较少，大多数实验室可进行样品制备。可用多种染色方案标记感兴趣特征。在临床前模型中，研究小鼠或兔子等小动物时，可收获肺并包埋，将整个肺切片置于一张显微镜载玻片上，以提供2D空间背景（2D spatial context）。该技术可实现的放大倍数足以研究亚细胞特征（参见Muhlfeld et al.，2021）。图1提供了示例，其中小鼠肺的完整器官切片和一个小气道横截面均展示了该方法的能力。电子显微镜可实现更高分辨率，有助于识别细胞内变化，但牺牲了视野即空间背景（Ochs et al.，2016）。因此，本文不再进一步讨论此方法。组织学切片，即使仅使用标准染色如苏木精-伊红（hematoxylin and eosin，HE）或甲苯胺蓝（toluidine blue），也可收集大量参数用于识别和量化病理改变。示例包括各种结构的体积和表面积、上皮变化、平滑肌质量增加或纤维化/炎症存在。使用体视学计数方案可确保无偏结果（Muhlfeld and Ochs，2013）。晚期凋亡也可通过形态学特征如膜出泡、核浓缩和凋亡小体形成来识别（Huppertz et al.，1999；Kumaraswamy et al.，2013）。然而，在器官固定过程中必须小心。由于肺是高度动态器官，在呼吸周期中改变形状，其形态高度依赖于施加的压力。因此，必须在生理压力设置下进行固定，超出该范围的压力会导致不现实的器官呈现。然而，精心调校的设置能够在特定生理（如吸气或呼气）或病理生理膨胀状态下固定肺（Perlman et al.，2024）。对于细胞内过程，如细胞周期停滞或凋亡早期阶段，可使用免疫组织化学标记物来可视化相关蛋白（Barranco et al.，2011；Xiao et al.，2015）。示例是激活的caspase 3，它存在于凋亡细胞中，其可视化可用于量化受影响细胞（Duan et al.，2003）。然而，LM的固有问题在于，单张组织学切片不提供3D背景。LM图像中的气道横截面难以归因于特定分支顺序。连接该气道截面与气管和肺泡的器官路径未知。参见图1中放大的气道。使用LM创建缺失3D背景的方法是对器官的组织学切片进行连续切片。这引入了问题，因为载玻片上组织切片的方向会变化。此外，在切割过程中组织可能被拉伸或压缩。为了能够将它们堆叠起来创建器官的3D表示，需要消除这些切片间差异。解决方法是图像配准（image registration）（参见Hill et al.，2001）。刚性配准算法会横向移动和旋转组织切片，而非刚性算法会纠正变形。然而，切片在切割和处理过程中可能以其他方式受损，配准无法充分纠正。示例包括撕裂、折叠、重大变形、染色不足或完全切片丢失。虽然存在缓解策略限制准备过程中引入的变形量（参见Taqi et al.，2018），但它们是计算组织学中的常见问题（Kanwal et al.，2022）。这些伪影在配准过程中会累积，并逐渐扭曲图像直至无法使用。因此，先前研究仅成功重建了小堆栈的组织学切片（Grothausmann et al.，2017）。图2示例了此类损伤。与其他器官相比，肺的稀疏组织含量似乎提供很小的结构完整性来抵抗切割过程中遇到的剪切力。除了这些问题，还应考虑以足够高分辨率研究亚细胞特征所需的工作量。以通常的1 μm至5 μm切片厚度，即使尺寸为几毫米的器官，在完全采样时也会产生数百张切片。仅收集子集则会导致失去空间背景，即单独切片子堆栈中可见结构之间的连接。

2.2 光片荧光显微镜
一种能够生成显微3D数据集的方法是光片荧光显微镜（light sheet fluorescence microscopy，LSFM）。在该技术中，只有体积标本的一个平面被一片光照射。被照射平面中的荧光染料因此被激发，并由显微镜作为2D图像捕获。通过移动样品或光源，可以移动光片。以这种方式，可以沿样品的一个轴收集一系列2D图像，并合并成3D图像体积。在小型生物体（如斑马鱼、小鼠胚胎）中可进行活体成像，但已到小鼠尺寸时，只有单个离体器官能以高分辨率成像。限制因素是照射组织的光散射。然而，可以通过例如化学透明化组织来克服尺寸限制（参见Huisken et al.，2004；Daetwyler and Fiolka，2023）。在肺研究中，该技术已成功应用于例如Yang等人（2019）绘制吸入纳米颗粒沿气道的分布（离体小鼠肺）。虽然该方法提供高放大倍数的3D数据，但依赖荧光标记。

2.3 活组织成像
上述方法存在一个主要限制，即它们大多限于成像固定组织状态，即固定和包埋时的细胞配置。因此，为了实时研究例如发病机制和治疗反应，需要在离体环境中研究活肺组织或进行活体成像。在此背景下，研究活组织的最古老技术是使用精密切割肺切片（precision cut lung slices，PCLS）。该方法中，取新鲜小鼠肺等器官，填充琼脂糖以稳定，然后在振动切片机上切片。对于较大动物或人类组织，使用活检样品而非全器官横截面。切片厚度通常为100 μm至500 μm，然后置于培养皿中的细胞培养基中，可研究长达14天。在此状态下，没有呼吸或循环。然而，仍有大量过程可观察。示例包括气道收缩或松弛、血管收缩和扩张、黏液分泌和纤毛运动、免疫细胞激活和介质释放、细胞外基质沉积或降解（参见Koziol-White et al.，2024；Liu et al.，2019；Viana et al.，2021）。组织培养可使用常见显微技术如明场或共聚焦显微镜和荧光成像进行成像。活细胞染色方案可用，用于实时追踪例如细胞迁移。然而，PCLS通常会在给予治疗或实验条件后的特定时间点以常规方式固定和包埋。例如，van Rijt等人（2015）使用靶向递送技术给药后量化凋亡肿瘤细胞。鉴于切片厚度，PCLS提供最小3D信息，但如同常规组织学切片，要生成完整3D器官表示，需要将连续切片相互配准。这可能因切割和后续孵育期间的结构变化而进一步复杂化。迄今为止，作者未发现任何报告尝试此类过程的出版物。一种克服PCLS限制（如缺乏循环和呼吸运动，以及缺少现实治疗递送选项）的方法称为晶体肋笼（crystal ribcage）。它由一个放置于透明肋笼模型中的小鼠肺组成，并外部灌注和通气。透明外壳允许对大部分肺表面进行光学成像。成像深度在空气填充肺泡中为100 μm，在光散射减少的区域如水肿肺泡中为500 μm。（参见图3b、c）。该方法在模拟或诱导的生理和病理生理状态下，以亚细胞分辨率可视化例如免疫细胞的血管运输或肺泡细胞方面表现出色（参见Banerji et al.，2023）。其使用示例包括使用荧光成像评估吸入颗粒沉积（Grifno et al.，2025）或癌症中机械肺特性的变化（LeBourdais et al.，2024）。然而，图像采集仅限于器官表面，深层结构不可见。例如，Grifno等人（2025）在晶体肋笼中气溶胶递送后使用PCLS评估传导气道在颗粒沉积中的作用。前述方法均使用离体肺，创建了与活体情况存在多种差异的实验设置。另一方面，活体显微镜（intravital microscopy）捕获器官在原位的显微图像，保留大部分自然器官周围环境。为此，在已移除部分肋骨的小鼠胸腔位置植入一个直径达1厘米的窗口。动物在手术过程中麻醉并通气。然后可通过窗口以类似晶体肋笼的方式成像，区别在于视野非常有限，且因持续麻醉成像时间窗窄（报告最长达3小时）。成像进一步仅限于胸膜下结构，最大深度达125 μm（参见图3e）。该方法的主要目标是血管成像，例如针对血红蛋白和氧饱和度或肺微血管中的免疫动力学（参见Hanna et al.，2013；Cleary et al.，2024；Looney et al.，2010）。该方法提供了评估活体过程的独特可能性，例如炎症反应中淋巴细胞从其他器官募集到肺。但其基本成像限制与晶体肋笼相同，且视野大大减小。

3 微计算机断层扫描
鉴于从2D切片创建3D图像体积的复杂性，或表面成像的有限成像深度，一种原生支持3D成像的替代技术，如微计算机断层扫描（micro computed tomography，μCT），似乎具有优势。它便于对完整器官进行无破坏性成像（参见Schambach et al.，2010）。组织可用四氧化锇（osmium tetroxide，OsO₄）或磷钨酸（phosphotungstic acid，PTA）处理以达到分析所需的对比度水平（Metscher，2009；Quintarelli et al.，1971）。图4a显示了PTA染色的小鼠左肺μCT扫描的体积渲染。μCT扫描产生的图像堆栈可进行分割，以创建感兴趣结构的模型，例如气道树（图4b）或肺血管。可用方法包括手动追踪结构、使用阈值算法如分水岭（watersheds）结合手动交互的半自动方法，或使用深度学习的全自动流程（Ronneberger et al.，2015；Isensee et al.，2020）。本文图像使用了后一种方法。使用了专门训练用于分割传导气道的神经网络。该模型来自专注于该形态结构的研究项目，此处用于演示，因为所得分割包含肺中大部分气道分支，并终止于一致的形态学边界，即从支气管上皮到气道上皮的过渡。所得分割图像可分析分支模式并相应进行颜色编码。已建立不同分支度量，例如标准代（standard generations）（Weibel，1963）或阶（orders）（Horsfield，1984），更适合高度不对称分支的方案（Strahler，1957），或更好匹配气道中颗粒沉积模式的方法（Wang and Kraman，2004）。此外，每个气道节段可进行单独标记，以促进分支节段水平的数据收集。本文应用了Strahler阶（Strahler order）（图4c、d）。它将阶1赋予气道树最远端节段，然后从外周向中央结构移动。两个相等阶相交时，下一节段阶增加。两个不等阶相遇时，保留较高阶。该方案特别适用于单足型肺的不对称分支模式，并产生高阶内形态相似性高的阶（参见Labode et al.，2022）。虽然上述方法适用于任何具有树状分支模式的结构，气道也可通过解剖学命名法分类（Thoracic Society，1950）。已有工作将该命名法适用于小鼠肺，并利用μCT扫描识别了不同小鼠品系的分支模式表型（Thiesse et al.，2010）。该方法在评估分支模式变异和比较单个中央气道分支方面具有优势。对于识别形态学上同质的气道节段组，其表现与标准代方法类似。叠加在μCT图像堆栈上的颜色编码分割图像可作为相邻分析结构（如气道壁或肺血管）的位置指示器（Labode et al.，2023）。此外，可分析分割结构本身的形态学参数，如总体积、分叉和节段数量、单个节段长度（Hemandez-Cerdan，2021）或局部直径（Dougherty and Kunzelmann，2007）。μCT的主要缺点是相比光镜可达到的分辨率有限。视野和分辨率之间存在权衡。虽然对小组织切片可实现纳米级分辨率，但小动物器官的体外成像提供约5 μm至10 μm的体素尺寸（Badea et al.，2008）。即使使用先进的同步辐射μCT（synchrotron radiation μCT，SRμCT），小鼠肺扫描的分辨率也不超过4.4 μm体素尺寸，在此过程中部分牺牲了一些远端组织切片（Labode et al.，2022）。因此，可评估的特征仅限于粗形态学，例如气道直径或壁厚。细胞表面分化，如纤毛异常或凋亡细胞出泡，远不可及。这限制了其在关注气体交换区域变化的研究问题中的使用。例如肺泡发生、纤维化重塑或炎症过程的观察仅限于主要形态学变化，而非潜在的细胞机制。图5演示了μCT实际能力与图1中LM能力的差异。对于气道分割，这意味着可可靠分割的最远端部分是肺泡管。然而，单个肺泡之间的隔膜分辨率不足，无法完成气体交换区域的完整分割。该区域内特征向特定气道的归因只能通过启发式方法进行，例如最近邻分类器（参见Hastie et al.，2009）。在LM图像中可使用多色染色等标记特定结构的能力，在单色μCT图像中非常有限。选项包括将金纳米颗粒与抗体配对，用作临床前和临床CT成像中的标记物（Hsu et al.，2020；Ashton et al.，2015）。由于颗粒尺寸，这些仅能结合到细胞表面，不能穿透内部。因此，它们无法用于可视化例如细胞内的凋亡信号级联。尽管如此，它们可用于标记炎症反应（Wyss et al.，2009）。对于细胞内过程如凋亡，有放射性示踪剂可用，但需要正电子发射断层扫描（positron emission tomography）来可视化。它们用于评估癌症患者的化疗结果（Beroske et al.，2021；Rybczynska et al.，2018），也可与离体成像结合（Maris et al.，2024）。除此之外，只能利用不同造影剂对不同组织类型的特定亲和力来在μCT扫描中可视化细胞特征。参见Keklikoglou等人（2019）的常见造影剂列表及其组织染色特性。

4 多步骤成像流程
4.1 已有工作流
鉴于上述成像方法的局限性，已有努力将多种成像技术组合成一个分析工作流，以利用各自的优势。Grothausmann等人（2021）设计了一种方法，将μCT数据和相应的LM图像配准到彼此，使得来自μCT体积图像分割的分支信息能够整合到高分辨率LM图像中，以提供空间背景。工作流如图6所示，包含以下步骤：器官在原位用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）灌注，然后收获，并保存在PFA中，直至如上所述进行μCT对比。然后将其包埋在用于后续切片步骤的包埋介质中（例如石蜡、环氧树脂），随后扫描以创建未受干扰的3D体积图像。此准备顺序确保了μCT和LM的相同条件，从而限制了配准过程中的校正需求。在此数据集上，进行感兴趣结构的分割（例如气道树、肺血管），并进一步分析，以及标记例如分支阶。同时，进行LM成像。为了最小化收集的材料量，同时确保无偏结果，遵循系统均匀随机抽样（systematic uniform random sampling，SURS）程序（Gundersen and Jensen，1987）。从随机起点开始，以特定间隔收集系列24张图像，厚度1-5 μm（取决于感兴趣结构）。这些组织切片的小样本系列在其系列内相互配准，形成一个小样本体积。这是必要的，因为单张切片被证明缺乏足够的具体特征来确保与较低分辨率μCT图像的充分配准。然后将μCT图像堆栈配准到单个LM图像堆栈。选择调整μCT图像以匹配LM图像的顺序，是为了尽可能少地扰动高分辨率LM图像。一旦完成此步骤，所得配准参数可应用于分割图像，使其能够叠加在LM图像上。最终结果是标记有例如气道阶的LM图像。然后可进行形态学分析，例如评估组织学图像中的细胞形状变化，结果可按气道阶分组。该技术已用于BPD模型，以位置依赖方式评估肺血管和气道，包括粗形态学和细胞特征（Labode et al.，2023；Pfleger et al.，2025），并已被证明是临床前研究中组间比较的宝贵工具。Reiser等人（2025）展示了一个包含更多成像模式的流程，增加了SRμCT和扫描电子显微镜（scanning electron microscopy，SEM）。此外，他们将流程扩展到猪肺，尺寸大致相当于人类肺。整个器官经福尔马林固定并石蜡包埋，随后用SRμCT扫描。基于此首次扫描，通过打孔活检提取感兴趣区域，并以更高分辨率扫描。从这些组织芯中，在切片机上对目标区域进行切片，并用LM成像。这些切片的子区域随后用SEM成像。没有进行例如从气管到肺泡的完整气道分割，而是对感兴趣结构进行了有限分割。核心活检也未配准到全肺扫描。然而，进行了活检核心μCT与LM以及LM与SEM之间的配准。这使得结构从活检核心追踪到SEM分辨率水平成为可能。Salg等人（2024）也在猪组织上工作。虽然针对胰腺，但其工作流程的一般概念部分受启发，并适用于肺研究。在他们的设置中，目标器官的血管在原位用造影剂灌注。成像流程随后包括临床全身CT、随后的更高分辨率全器官离体扫描和亚器官级扫描（μCT和SRμCT）。然后对高分辨率扫描中的一段血管进行分割并分析分支模式。然而，该流程不包括不同成像模式之间的图像配准。因此，例如概述图像中的主要血管无法精确追踪到高分辨率亚器官图像。

4.2 免疫组织化学标记物的整合
在细胞特异性改变的背景下，细胞内过程的评估很重要。然而，先前的多步骤成像流程并未特别尝试纳入这一点，而是依赖基本组织学染色进行位置特异性细胞形态学评估。因此，研究人员提出了Grothausmann等人（2021）设计的工作流的新扩展，通过整合免疫组织化学标记物（immunohistochemical markers）。它们允许可视化存在于细胞内、细胞表面或细胞外空间中的特定物质。分析目标的示例包括用于细胞鉴别的club细胞蛋白（Zuo et al.，2018）或前表面活性剂蛋白-C（prosurfactant apoprotein-C，SP-C）（Kim et al.，2005），用于细胞状态如DNA损伤的p21或p53（O'Reilly et al.，1998），以及用于触发凋亡级联的激活caspase 3、8或9（Tyas et al.，2000；Xiao et al.，2015）。在此上下文中需要区分两种不同的技术。免疫组织化学（immunohistochemistry，IHC）通过使用特异性结合蛋白的抗体来标记蛋白。这些抗体可通过与催化显色反应的酶偶联或与荧光团（fluorophore）偶联来可视化。后一种选项称为免疫荧光（immunofluorescence，IF）。为了可视化荧光团，需要用特定波长的光激发，然后它会发射不同波长的光（Joshi and Yu，2017）。在IF显微照片中，因此只有标记的结构可见。准备时间取决于样品尺寸、孵育时间、包埋介质等。对于此步骤，可参考标准方案（参见Hewitson and Darby，2010；Del Valle，2022），它们将决定各自的时间要求。由于IHC过程与组织学标准染色兼容（参见Ramos-Vara，2005），因此不需要固有地调整单个LM切片之间或LM图像堆栈与μCT体积图像之间的配准过程。只有当标记在单个LM切片之间添加过多信号波动或创建与μCT图像信号模式差异很大的信号模式时，才可能需要对图像强度进行阈值处理。如果要使用IF，则需要对工作流进行更广泛的调整。从相关光镜和电子显微镜的既定方法可知，OsO₄处理可降低许多荧光蛋白的强度。此外，用于包埋的环氧树脂可能表现出与预期荧光信号竞争的自发荧光水平（Kopek et al.，2017；Tanida et al.，2024）。因此，应使用其他造影剂如PTA以及包埋材料如石蜡或甲基丙烯酸酯。对于μCT和IF图像之间的配准，应使用一般组织标记物，例如针对上皮细胞表面的小麦胚芽凝集素（wheat germ agglutinin，WGA）（Chazotte，2011）或组织自身的自发荧光，以紧密匹配μCT图像信号分布。一旦完成任一方法的配准过程，即可根据需要将配准后的分割叠加与不同成像模式结合。对于本文展示的示例，除了常规组织学准备外，小鼠左肺还用PTA染色过夜，随后包埋在石蜡中，并在μCT扫描仪中扫描。这无疑是一个高端设备，可能对一些机构来说过于昂贵。然而，先前研究（Grothausmann et al.，2021；Labode et al.，2023；Pfleger et al.，2025）成功使用了更便宜的桌面设备扫描。虽然此类设备只能处理有限样品尺寸并提供降低的信噪比，但当仅研究小动物肺时，它们可用于此工作流。扫描时间约为两小时。如果时间有限，也可以使用更快的扫描时间，但图像质量会降低。所得体积图像，等向体素尺寸为6.67 μm（图4a），使用nn-Unet（Isensee et al.，2020，图4b）进行分割，该网络已在另一个已分割的小鼠肺样品系列上训练。此处，使用Generation Analysis Toolkit（Labode and Haberthtir，2024）对传导气道的μCT分割进行了Strahler阶颜色编码（图4c）。计算时间高度依赖于所用硬件和图像尺寸。因此，此处列出的时间应理解为数量级值。本文执行的计算步骤在Linux服务器和汉诺威医学院高性能计算集群之间分配，使用了类似资源。也可使用功能较弱的硬件，但计算时间更长。所有用于分析的软件都是免费开源的。μCT体积图像的分割在大约两到三小时内完成。无需对所得分割图像进行手动校正。此数据集的分支分析运行了类似时间。μCT扫描后，从组织块上切取切片，并用二甲苯去除石蜡。使用pro-SP-C标记物进行过夜染色，随后应用WGA染色两小时。在切片机上切片每个堆栈24张切片约需半小时。所需堆栈数量取决于器官大小和采样方案，而采样方案又取决于感兴趣特征。一个示例采样方案取自Labode等人（2023），即每300 μm收集24张连续4 μm厚切片。对于两个兔肺，这分别产生14和17个堆栈，相当于每个大约一个工作日的准备时间。将切片厚度减少到2 μm，堆栈间距减少到100 μm，则将工作量增加约1.5倍。所得组织学切片随后需要数字化。使用Zeiss Axioscan Z1显微切片扫描仪。它可以进行明场和荧光成像，一次处理多达100张切片，并可处理一张载玻片上的多个器官切片（根据器官大小，一张载玻片上可放两到三张切片）。扫描时间主要取决于切片尺寸和放大倍数设置。IF切片的扫描时间取决于所用标记物数量，即两个标记物需要两个不同波长光的扫描周期，等于可比明场图像采集所需时间的两倍。扫描过程完全自主，扫描持续时间大致为过夜，即下午装载切片，次日上午卸载。也可使用更简单的相机/显微镜设置，但手动工作量增加。由于IF染色对外部应激源高度敏感，切片应避光保存，并可能冷藏直至成像。染色和成像之间的时间应保持最短，即数小时而非数天。在随后的配准过程中，使用软件elastix（Klein et al.，2010；Shamonin，2013），将μCT体积图像变换以实现与IF图像的最佳拟合。图7说明了各个步骤。使用由此操作得到的配准参数，分割图像可以相同方式调整，然后叠加在相应IF切片上。结果可视化于图8，μCT提供的额外3D背景在图9中。单个堆栈内各切片之间的图像配准每个堆栈再次需要两到三小时。在某些情况下，结果被认为不满意，图像被调整。最后一项准备任务是μCT和LM/IF堆栈之间的配准。此处，每个堆栈的时间大致等于之前的配准任务。在某些情况下，需要调整堆栈相对于全器官体积的空间位置并重复执行。所有计算作业在运行时几乎不需要手动交互。它们可以脚本化以高效方式运行，质量控制可在适当时间进行。因此，花费在这些任务上的手动工作仅为计算时间的一小部分。在所得图像中，WGA染色标记所有细胞边界，而pro-SP-C标记物突出显示含有SP-C的特定细胞。气道中标记的细胞是支气管肺泡干细胞，是细支气管和肺泡之间过渡区的特征。在肺泡区域，标记了II型肺泡细胞。在旨在量化气道内支气管肺泡干细胞分布的研究中，每个气道截面对标记细胞进行计数。流程此最终分析步骤所需时间高度取决于研究目标。如果仅需收集沿分割气道的罕见细胞类型位置，可能只需数小时。另一方面，如果需要在不同气道分支阶获取代表性细胞类型及其尺寸，则可能需要数周的细胞识别和测量。未来，特征识别的自动化可能取代这些手动分析步骤。虽然本综述背景下细胞死亡标记物更合适，但此类演示需要来自肺损伤模型的新鲜样品材料。由于此类模型引发的伦理关切，合适材料稀缺，撰写时不可用。虽然正常细胞更新和细胞死亡存在于成年肺中，但比率极低，在采样区域目睹此类事件是偶然相遇。因此，此处使用pro-SP-C标记物进行演示，因为它是肺生理状态下存在的蛋白质的成熟且稳健的标记物。尽管如此，本文演示作为概念验证，说明了将IF成像整合到现有工作流中的可能性。在适当的模型设置中，此过程可以类似方式使用不同标记物进行，例如用于凋亡的成熟cleaved caspase 3或9标记物。在设计使用上述工作流的研究时，研究人员可微调设置以满足其需求。然而，最基本的决定是免疫组织化学标记方法的选择。因此，将讨论一些优缺点。IHC更容易整合到成像过程中，因为它仅需要常规LM图像。它还允许使用标准染色和酶标记的组织化学过程同时评估组织形态学。这促进了组织中形态学和化学变化的直接关联。染色也更稳健，例如抗光漂白。另一方面，IF更脆弱，因为它会迅速褪色，并可能因光暴露而降解。因此，样品可能需要快速连续进行染色和成像，特殊储存条件，且可能不允许重复成像。配准过程可能需要额外的图像模式（即除特异性蛋白标记物外的一般标记物）。这意味着额外的染色步骤和成像时间。然而，当目标蛋白量很少，在基本IHC应用中可能难以识别时，IF方法表现出色。此外，可在不同波长同时使用多种标记物，允许在同一组织切片中检测不同物质。本文呈现的工作流的一个主要特征是根据沿气道树的位置引用发现。这一元素对于研究结果在动物和人类肺之间的转化很重要。如何执行此类转化高度依赖于所用动物和感兴趣结构。因此，此处仅提供一般性方面、示例和限制，而非详尽描述。一个主要考虑因素是气道分支模式。在人类肺中，它们以相对对称的方式分支，每个气道分支在分裂时产生两个形态相似的子分支（Weibel，2009）。另一方面，常见实验动物表现出高度不对称的所谓单足型分支模式，其特征是中央气道长，侧支显著较小（Phalen and Oldham，1983）。这种不对称性是在这些肺中无法进行代归因的原因。因此，当比较粗形态学时，小鼠肺中阶6和7的气道部分（如图4c、d所示）是最接近人类肺较大支气管的结构。然而，除分支模式差异外，还存在进一步的结构差异，将影响物种间转化。例如，人类支气管中存在的软骨或黏液腺在小鼠、大鼠或兔子中不存在。此外，例如兔子的杯状细胞仅在最近端气道中发现。因此，当研究黏液纤毛清除时，兔肺的较大传导气道更接近人类肺较小细支气管的情况，其中腺体缺失，杯状细胞负责黏液产生，直到在远端细支气管中被club细胞取代并过渡到表面活性剂系统。在这种情况下，将动物肺的较高阶匹配到人类肺的细支气管代可能更合适，而支气管模型则需要另一种动物物种。当研究气体交换区域时，需要考虑小鼠或兔子不拥有或仅在罕见情况下拥有呼吸性细支气管，而它们在人类肺中约占三代。因此，虽然可以在物种之间对肺泡管和肺泡囊进行结构比较，但小鼠模型中没有呼吸性细支气管