大黄素(Emodin)处理与黄河鲤鱼(Cyprinus carpio haematopterus)对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)抗性增强相关，并与肠道 microbiota–immune–metabolic 调控有关：一项多组学研究

《Frontiers in Immunology》：Emodin treatment is associated with enhanced resistance to Aeromonas hydrophila and correlates with gut microbiota–immune–metabolic modulation in Yellow River Carp: a multi?omics study

　　

引言：嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是水产养殖中细菌性肠炎的主要病原，也是威胁鱼类产品安全的病原；亟需抗生素的可持续替代品。本研究以黄河鲤鱼(Cyprinus carpio haematopterus)为对象，探讨大黄素(Emodin)的潜在效应。方法：采用黄河鲤鱼为模型，运用多组学方法（包括16S rRNA/ITS测序与非靶向代谢组学），并结合存活率、肝与肠组织病理学、群体感应相关毒力基因表达，以及血清免疫球蛋白M(IgM)与溶菌酶(Lysozyme, LZM)活性评价。结果：大黄素(Emodin)处理提高了存活率，减轻肝与肠病理损伤，下调群体感应相关毒力基因(AhyR、LapA、AerA)，增强血清IgM与LZM活性。16S rRNA/ITS测序显示，大黄素增加了子囊菌门(Ascomycota)、厚壁菌门(Firmicutes)、德巴利酵母属(Debaryomyces)与乳球菌属(Lactococcus)的相对丰度，同时降低Bosea属与军团菌属(Legionella)等菌属。非靶向代谢组学表明代谢谱发生显著改变。相关性分析揭示，大黄素富集的 microbiota 与代谢物及细胞因子 il-1β 和 tnf-α 显著相关。讨论：大黄素(Emodin)处理与黄河鲤鱼抗感染能力增强相关，伴随肠道 microbiota、代谢与免疫反应的显著改变，凸显其作为水产养殖中环境友好型免疫刺激剂的巨大潜力。

论文发表在《Frontiers in Immunology》。研究背景方面，黄河鲤鱼(Cyprinus carpio haematopterus)是黄河流域特有且具有经济价值的鱼类，因其优良肉质与丰富营养被广泛消费，其微生物安全日益成为公共卫生关注点。集约化养殖扩张及与其他品系杂交导致该物种遗传多样性下降、抗病力减弱及种质资源退化，感染性疾病成为限制其可持续健康养殖的关键瓶颈。嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)是淡水鱼出血性败血症与肠炎的主要病原，能产生并分泌多种毒力因子，感染可致腹水、肝肾损伤、肛门出血及鳍溃疡等临床症状，常引发高死亡率与重大经济损失。长期以来，抗生素广泛使用是控制细菌性鱼病的主要手段，但过度使用导致嗜水气单胞菌多重耐药增加及抗生素残留问题，亟需环境友好的替代防控策略。大黄素(Emodin)是从大黄与虎杖(Polygonum cuspidatum)等植物中提取的蒽醌衍生物，在水生动物中显示出促生长、抗氧化、抗炎及调控肠道 microbiota 的潜力，膳食补充可经调控肠道 microbiota 增强鲤肠道免疫防御并促进正常生长，但现有研究多聚焦表型改善与一般免疫参数测定，缺乏对其潜在机制的系统性探究，尤其大黄素在具独特遗传背景的黄河鲤鱼中的效用与分子机制尚未被全面阐明。为此，研究人员采用整合多组学方法，探究大黄素保护黄河鲤鱼抵抗嗜水气单胞菌感染的分子机制，为大黄素作为绿色饲料添加剂在黄河鲤鱼养殖中的应用提供理论基础，并从肠道 microbiota、代谢与免疫反应整合视角为草本添加剂提供新机制见解。

为开展研究，研究人员使用平均体重10.17 ± 0.05 g的黄河鲤鱼（来源于河南省水产科学研究院燕辉王），设置对照组(CON)、大黄素组(EM)、嗜水气单胞菌组(AH)与大黄素加嗜水气单胞菌组(EMAH)，每组三个重复，每缸50尾鱼；大黄素以50 mg/kg剂量每日经口灌胃连续14天，随后AH与EMAH组腹腔注射嗜水气单胞菌(1 × 10⁸CFU/mL，按1 μL/g体重)，CON与EM组注射磷酸盐缓冲液(PBS)；于攻毒后24小时采样，样本来自三个重复缸中各随机选取2尾鱼共6个生物学重复，用于生化测定与组学分析；主要关键技术方法包括生存分析与组织病理学评估、实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测毒力基因与免疫基因表达、氧化与免疫生化指标测定、基于16S rRNA（V3–V4区）与ITS（ITS2区）扩增子的肠道微生物群落测序、液相色谱–串联质谱(LC–MS/MS)非靶向代谢组学分析，以及基于Spearman相关性的 microbiota–代谢物–免疫因子多组学关联分析。

结果部分如下。3.1 Effects of emodin on survival rate and clinical symptoms of Yellow River carp infected with Aeromonas hydrophila：通过病原攻毒试验发现，EMAH组存活率达47.0%，显著高于AH组；EMAH组临床体征如体色、皮肤出血、肠与肛门充血均较AH组减轻；组织细菌负荷定量与菌落计数显示EMAH组肝、肠、鳃中嗜水气单胞菌负荷显著低于AH组；qRT-PCR显示大黄素下调AhyR、LapA与AerA毒力基因mRNA水平，绝对定量显示EMAH组各组织细菌拷贝数显著低于AH组，表明大黄素的保护作用可能与这些分子改变密切相关。3.2 Emodin alleviates Aeromonas hydrophila induced intestinal injury and regulates immune gene expression as well as antioxidant enzyme activities：组织病理学显示AH组肠黏膜上皮与固有层受损，绒毛上皮变性坏死、点状出血、杯状细胞减少及绒毛断裂，EMAH组上述结构损伤明显减轻；基因表达上，AH组上调促炎细胞因子tnf-α与il-1β、下调抗炎细胞因子tgf-β与il-10，EMAH组促炎基因表达低于AH组而抗炎基因高于AH组；抗氧化系统显示AH组丙二醛(MDA)含量升高，总超氧化物歧化酶(T-SOD)、总抗氧化能力(T-AOC)与过氧化氢酶(CAT)活性降低，EMAH组MDA降低且上述抗氧化酶活性升高；肠中免疫球蛋白M(IgM)、溶菌酶(LZM)、补体C3与C4活性在AH组低于对照组，EMAH组不同程度恢复，表明大黄素缓解肠损伤并调节局部免疫与抗氧化状态。3.3 Emodin alleviates hepatic damage and modulates immune gene expression and antioxidant enzyme activities in Yellow River carp infected with Aeromonas hydrophila：肝组织病理学显示AH组肝索结构紊乱、点状出血、炎性细胞浸润、细胞水肿与固缩，EMAH组上述病变较AH组明显减轻；分子层面AH组肝中il-1β与tnf-α上调、il-10与tgf-β下调，EMAH组促炎因子较低而抗炎因子较高；抗氧化与肝损伤指标显示EMAH组肝T-AOC、SOD与CAT活性高于AH组，谷丙转氨酶(GPT)、谷草转氨酶(GOT)与MDA在AH组显著升高而EMAH组降低并接近对照水平，提示大黄素减轻感染相关肝损伤。3.4 Effects of emodin on systemic immune parameters：EMAH组血清补体C3、补管C4、IgM与LZM活性较对照组显著升高，且C3、C4与IgM显著高于AH组，LZM在EMAH与AH间无显著差异，表明大黄素对感染条件下黄河鲤鱼全身免疫相关参数尤其是IgM与补体C4活性具有一定增强作用。3.5 Effects of emodin on intestinal microbial community structure of Yellow River Carp infected with Aeromonas hydrophila：3.5.1 Bacterial community structure：ASV分析共鉴定7517个ASVs，EMAH组总数最高(2460)且独有1669个；α多样性无显著差异，β多样性显示组间差异显著，Adonis检验确认；门水平上AH组变形菌门(Proteobacteria)比例显著高于其余组，EMAH组厚壁菌门(Firmicutes)占47.59%；属水平EMAH组乳球菌属(Lactococcus)相对丰度(20.56%)显著升高，Bosea与军团菌属(Legionella)等丰度降低，LEfSe分析识别差异菌属。3.5.2 Fungi Microbial composition analysis：真菌ASV共1435个，AH组最高(293)；β多样性显著不同；门水平AH组担子菌门(Basidiomycota)增至76.34%、子囊菌门(Ascomycota)降至23.63%，EMAH组子囊菌门回升至27.98%；属水平AH组曲霉属(Aspergillus)增至46.68%、德巴利酵母属(Debaryomyces)降至1.08%，EMAH组曲霉属降至39.42%、德巴利酵母属升至9.74%，LEfSe证实差异。3.6 Effects of emodin on host metabolomic characteristics after infection：代谢组质控良好，保留28746个峰并最终注释3221个代谢物；PCA显示各组代谢物分布无重叠；差异代谢物分析显示EMAH较AH有150个下调与968个上调代谢物；通路富集显示CON vs EM差异代谢物富集于牛磺酸与亚牛磺酸代谢，CON vs AH富集于淀粉与蔗糖代谢及半乳糖代谢，AH vs EMAH富集于氨酰-tRNA生物合成、氮代谢及苯丙氨酸、酪氨酸与色氨酸生物合成；趋势分析识别6个模块，选取模块1、5、6进行KEGG富集，主要涉及淀粉与蔗糖、卟啉与半乳糖代谢通路。3.7 Integrated analysis reveals microbiota–metabolism–immunity interactions：构建前500 ASVs的共存网络，AH组感染后网络复杂度增加而EMAH组显著降低；中心ASVs分析显示Bosea属细菌ASV与Debaryomyces属真菌ASV分别为关键节点；Spearman相关显示EMAH组Debaryomyces与Lactococcus丰度较高且与彼此正相关、与Bosea和Legionella负相关；Debaryomyces和Lactococcus与Gly-Pro-Arg、N-oleoyl phenylalanine等代谢物负相关，Bosea与Legionella与之正相关；Debaryomyces与促炎因子il-1β和tnf-α表达负相关，Bosea与Legionella与之正相关，表明大黄素的保护作用与特定微生物类群、宿主代谢谱及免疫反应改变相关。

讨论部分总结如下。研究人员在讨论中指出，集约化水产养殖中绿色防控是制约产业可持续发展的瓶颈，大黄素处理与抑制病原毒力表达、增强宿主免疫防御与抗氧化屏障、调控肠道 microbiota 结构与宿主代谢稳态相关，其降低毒力可能有助于减少收获后微生物风险。大黄素提高存活率并减轻肝肠损伤，可能与下调AhyR、LapA、AerA毒力基因及调节炎症与抗氧化指标有关。肠道 microbiota 中，大黄素组厚壁菌门与子囊菌门丰度较高，变形菌门与担子菌门较低；属水平富集Debaryomyces与Lactococcus，降低Bosea与Legionella，网络中心性增强。研究中嗜水气单胞菌未在属水平成为优势菌可能与攻毒途径、剂量、采样时间24小时及宿主免疫清除有关。多组学关联显示Debaryomyces和Lactococcus与特定代谢物负相关且与促炎因子负相关，Bosea与Legionella呈正相关，提示大黄素与宿主炎症反应相关。研究局限在于仅在攻毒后24小时单时间点分析，未来需多时间点、蛋白水平验证及无菌动物或粪菌移植探究因果，代谢物需标准品靶向验证，具体分子靶点与信号通路待深入。

结论部分翻译如下：这项多组学研究证明，大黄素能有效增强黄河鲤鱼对嗜水气单胞菌感染的抵抗力。实验观察到大黄素处理组存活率更高，肠与肝损伤更轻，病原毒力基因表达水平更低。此外，大黄素处理组在抗氧化与免疫反应相关指标上有所改善，肠道 microbiota 结构与宿主代谢谱也与未处理组不同。这些发现表明，大黄素可作为可持续水产养殖中环境友好型免疫刺激剂，并可能有助于减少养殖鱼类中嗜水气单胞菌的携带。