《Frontiers in Immunology》：Spatial multiomics to inform immunocytokine engineering: knowledge base, gaps, and QC solutions
系统性促炎细胞因子疗法（如IL-2）是免疫疗法的早期里程碑，但其应用受限于低响应率和严重的脱靶毒性。相比之下，免疫细胞因子（immunocytokines）将细胞因子直接递送至肿瘤，减少全身毒性并增强疗效。空间组学（Spatial-omics）深入揭示肿瘤微环境（TME），能够识别可成药靶点，加速新型抗体平台和细胞因子载荷（payloads）的开发。然而，患者样本质量的变异性影响数据完整性，平台差异需要不同的预处理流程。时空数据要求空间聚类（spatial clustering）来定义疾病相关的微环境（niches），但关于微环境构成的共识缺乏，使得解释和可重复性复杂化。为克服这些挑战，研究人员需要改进样本收集和处理，并协调平台多样性及其在微环境识别中的技术局限性。通过结合关键TME细胞类型和标记物表达与从自身免疫数据集中鉴定的细胞因子，可以设计创新的免疫细胞因子以改善靶向性、有效性和患者预后。
### 1 Introduction: spatial technologies and the role of cytokines in the TME
肿瘤是由基质、恶性和免疫细胞群构成的高度结构化动态生态系统，通过创建局部的细胞环境（即肿瘤微环境，TME）驱动肿瘤演化。肿瘤相关细胞因子以高度局域化、异质性的模式发挥作用，深刻影响TME内的免疫细胞招募、激活和抑制。传统的批量（Bulk）和单细胞RNA测序（RNAseq）分析会解离组织，无法原位分析免疫状态如何参与局部TME的构建与维持。利用空间多组学（spatial multi-omics）技术（如TGFβ、IL6、CXCL12和IFNγ等细胞因子在肿瘤中发挥区域特异性效应并促进表型可塑性）对局部TME进行剖析，能够识别侵袭性或治疗抵抗状态。理解细胞因子的产生和作用位置，对于解释功能性免疫抑制、抗原呈递微环境以及局部免疫治疗失败至关重要。随着细胞因子靶向免疫疗法和联合方案的发展，空间技术已不再是可选工具，而是识别可干预的微环境（micro-niches）、根据空间免疫结构对患者进行分层以及设计克服局部免疫抑制干预措施的必要平台。
空间分辨率分子谱分析技术主要分为空间转录组学（spatial transcriptomics, ST）和空间蛋白质组学（spatial proteomics）两大类。2016年引入的ST方法通过空间条形码阵列捕获poly(A)+ RNA并测序以重建全转录组数据，该方法后被10x Genomics商业化（Visium），并优化为Visium v2（提高灵敏度并集成自动化流程）。Visium平台以伪批量分辨率获取转录组数据，受限于55 μm的圆形捕获斑点网格排列。10x Genomics后续开发了Visium HD，将斑点尺寸缩小至2 μm，实现近亚细胞分辨率。与此同时，基于成像的ST技术涌现，包括Bruker CosMx和10x Genomics Xenium，两者均采用条形码检测系统识别mRNA转录本，并通过细胞分割实现亚细胞分辨率。MERFISH（由Vizgen开发）是另一种高分辨率成像方法，利用组合条形码和连续smFISH成像实现高效检测，提供单细胞到亚细胞的空间分辨率，但受限于靶向探针面板（通常捕获数千个mRNA种类）。近期基准测试研究系统比较了这些商业ST平台，发现10x Xenium、Vizgen MERFISH和Bruker CosMx在灵敏度、特异性、分辨率和生物学效用上存在差异：Xenium每个基因的转录本计数更高；Xenium和CosMx与正交单细胞RNA-seq数据一致；所有平台均能进行空间细胞分型，但假发现率和细胞分割错误率不同。对脱靶mRNA探针结合的分析显示，CosMx的探针特异性优于Xenium。细胞分割性能是另一个关键区分因素：Visium因伪批量斑点架构无法实现真正单细胞分割，Visium HD通过连续条形码方块部分解决此问题，但精准分割仍具挑战；而CosMx、Xenium和MERFISH通过膜相关抗体染色支持单细胞分割，但各平台在分割流程的实施、准确性和整体性能上存在显著差异。当前策略倾向于联合使用伪批量技术（如Visium或Visium HD）与单细胞分辨率技术（如CosMx、MERFISH或Xenium）。
空间蛋白质组学平台同样在多个技术方向上发展：多离子束成像（MIBI）和CODEX利用成像质流式细胞术同时检测50–100种蛋白标志物；循环免疫荧光（cyclic immunofluorescence）方法（如Lunaphore COMET平台）通过顺序孵育和抗体剥离生成多重免疫组化数据；Bruker GeoMx允许用户获取超过1000种蛋白标志物（包括翻译后修饰），但限于低分辨率（用户定义区域直径50–600 μm）；MALDI基于成像质谱，属高通量低分辨率平台。多项空间多组学研究表明，整合组织病理学与转录组和蛋白质组层能够揭示隔室特异性生物学，并发现恶性转化背后的新兴分子程序。例如，CITE-seq结合多重空间成像揭示了与黑色素瘤免疫治疗效果相关的B细胞特征富集的肿瘤周围淋巴聚集；空间转录组学和蛋白质组学被用于表征10种癌症类型中的癌症相关成纤维细胞（CAFs）；在低级别浆液性癌中，整合分析发现了显著的RNA-蛋白质解耦和微环境特异性信号网络，强调空间背景如何塑造肿瘤演化。空间转录组学进一步凸显了由局部免疫浸润和基质-免疫-肿瘤交互驱动的肿瘤异质性，揭示了免疫效应分子和细胞因子表达的空间梯度，这些梯度影响疾病进展和免疫治疗响应。空间蛋白质组学研究以单细胞分辨率绘制了蛋白质水平的免疫信号，揭示了细胞因子丰富的微环境和直接导致治疗抵抗的免疫抑制网络。
### 2 What spatial systems have already taught us (knowledge base)
空间多组学技术已在以下方面展示了实用性：- 空间映射与细胞因子生物学相关的免疫和基质微环境：空间技术揭示了跨癌症类型的基因调控网络，识别了与预后相关的肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）表型，绘制了CAF异质性，并揭示了驱动演化和治疗抵抗的局灶环境。例如，IL4I1
+巨噬细胞与结肠癌良好预后相关，而NLRP3
+和SPP1
+巨噬细胞标记与不良预后相关的坏死区域。CAF的空间映射显示了反复出现的CAF-癌症共定位或CAF-巨噬细胞共定位模式，这些模式塑造了T细胞浸润和细胞因子扩散屏障。- 空间配体-受体拓扑学指导免疫细胞因子设计：空间转录组学揭示细胞因子受体的积累位置、其与T细胞、NK细胞和巨噬细胞聚集的对齐方式，以及基质元素如何调节其可用性。高分辨率图谱可显示局部受体梯度（如IL-2受体亚基CD25/CD122），指导受体偏向变异体的工程化，并可识别细胞因子被细胞外基质（ECM）固定或被竞争性细胞类型清除的区域，从而为免疫细胞因子的连接子长度、亲和力调谐和ECM锚定基序提供决策依据。- 空间蛋白质组学解析RNA-蛋白质不匹配：由于RNA丰度不一定预测蛋白质定位、激活状态或细胞间距离，高plex空间蛋白质组学对于验证免疫细胞因子受体的可用性至关重要。测量超过1000种蛋白的空间蛋白质组学面板有助于识别受体热点、激活表位和潜在诱饵受体，从而实现更准确的载荷选择和受体结合预测。
### 3 Gaps limiting translation of spatial biology into immunocytokine engineering
尽管有这些突破，仍需关键性改进以充分利用空间多组学技术的能力。
#### 3.1 Technical quality control
空间多组学技术在患者组织上的应用提供了组织架构内基因和蛋白质表达的无与伦比的见解，促进了疾病生物学和治疗开发。然而，从组织获取到数据分析的流程复杂性使得严格的质量控制（quality control, QC）不可或缺。每一步都可能引入变异性，损害数据完整性、可重复性和生物学解释。早期环节的QC不足会导致伪影，掩盖空间关系。此外，空间实验消耗大量资源且耗时，QC失败后重复实验成本高昂且延迟研究。次优的组织质量和检测条件会负面影响下游流程，因为组织制备或成像中的错误会通过分割、定量和分析传播，导致误导性生物学结论。
##### 3.1.1 Tissue QC
福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）组织块的完整性以及mRNA和蛋白质的保存是生成高质量空间组学数据集的基础。患者组织材料的延迟或不适当固定会导致RNA降解和蛋白质交联伪影，对空间数据产生严重影响。仪器供应商已建立良好实践标准，确保仅使用高质量组织。例如，Bruker建议5 mm厚度的组织固定18至24小时，且患者材料在切除后立即放入固定液以获得最佳结果。在将样本投入空间流程前，应使用严格且可预测的QC检测，仅将高质量材料纳入数据集生成。仪器供应商建议使用DV200或RIN等测试评估mRNA质量，但这些并不总是与生成数据集的质量相关。因此，仅应考虑接近推荐QC评分最大值组织用于数据集生成。一旦从选定患者中识别出合适组织样本（确保下游分析统计效力），需以组织学保留和mRNA保存为考量生成切片。应选择高质量玻片以确保FFPE组织切片在整个过程中牢固附着。应避免组织切口或褶皱。切片应厚度均匀（通常4–5 μm），整个研究使用相同厚度。此外，应选择代表所有相关细胞类型的切片，以确保捕获细胞因子通路。
##### 3.1.2 Tissue preparation and considerations for instrument parameters
许多空间转录组学技术整合基于抗体的分割标志物，以确保正确识别组织细胞用于下游分析。空间蛋白质组学同样依赖标志物进行细胞分割。这需要适当的组织制备和消化，以保留蛋白表位同时保证mRNA分子对探针的可及性，且避免mRNA降解。每种组织类型的最佳条件需实验验证并在系列中一致应用以避免批次效应。将FFPE切片加载到仪器后，需选择视野（Fields of View, FoVs）。应避免已脱落的组织部分或明显失焦的区域。组织边缘构成挑战，因为外围的FoV包含空区域，人为降低QC分数，因此应尽量避免不必要空白区域。次优的组织制备和FoV选择会导致信号丢失，对生成数据产生不良后果。
#### 3.2 Computational limitations
##### 3.2.1 Cell segmentation
空间多组学技术在分辨率、数据采集方式、plex和灵敏度上显著不同。例如，基于成像的ST的条形码质量、基于循环IF的SP的背景荧光信号、或成像质流式细胞术实验中的抗体标记批次效应，均以不同方式影响原始数据质量。因此，这些技术生成的数据不能以相同方式处理，需要平台特定的质控方法。这突出体现在各平台采用的不同细胞分割方法上。Visium和Visium HD使用H&E图像进行分割，而CosMx、Xenium、MERFISH以及CODEX、MIBI、COMET等平台使用荧光染色的抗体混合物图像。此外，各平台开发了本质上不同的自定义算法。最后，存在大量公开可用的细胞分割算法可用于细化细胞边界。
##### 3.2.2 Batch corrections
空间组学数据通常高plex、稀疏且由于组织固有异质性而几何不规则，使数据归一化和批次效应校正复杂化。批次效应可能源于生物学异质性（如采样偏差和供体队列）或非生物学因素（如仪器、成像和测序）。多种批次校正算法旨在减轻不同批次效应，基准测试研究确定Harmony、LIGER和Seurat为强表现者，但不过度校正地去除批次效应仍是挑战。该领域的最新创新集中在两个方向：开发统计框架以评估和告知批次效应的性质，同时开发专门针对空间解析多组学数据的新算法。这些因素不可避免地引入技术特定偏差或错误，进而被放大并传播，影响下游分析的可解释性和可重复性。
##### 3.2.3 Niche reconstruction
组织稳态源于分子和细胞过程的复杂相互作用。理解单细胞如何组装成空间组织的微环境（niches）并激活背景依赖性基因表达和细胞间通信程序是现代生物学的核心挑战。空间解析多组学通过保留细胞位置重建组织架构，但需要应用空间微环境框架才能揭示疾病机制。空间微环境的计算发现已迅速发展。早期方法依赖固定最近邻窗口（通常10–200个细胞）推断局部细胞组成，在空间蛋白质组学中有效，但应用于高维ST数据时会引入偏差。后续的概率和贝叶斯模型（如HMRF、BayesSpace、DRSC）整合基因表达与空间邻接性，通过Potts模型将细胞分配到软边界的微环境中，但高度异质性组织中相邻细胞未必共享表型相似性。BASS算法通过整合分层模型以捕获跨空间域的基因表达变化改进了这一点。新一代算法采用基于图论和深度学习的策略（如SCGP、SpaGCN、STAGATE、GraphST、Giotto、UTAG、CellCharter、BANSKY、scNiche），利用最近邻或半径距离（通常50–200 μm）构建细胞网络，整合基因表达、空间拓扑甚至组织学图像以解析精细微环境。然而，方法学选择（如网络构建、半径选择和降维）强烈影响微环境检测。高表达或广泛表达的基因（尤其是谱系标志物）可能掩盖细微状态转换，因此需要互补分析方法如空间自相关方法（InSituCor、Hotspot）来独立于细胞身份检测局部基因模块。基准测试研究强调，没有单一方法在所有组织类型、分辨率或平台上表现最优。因此，将空间计算框架与专家组织病理学解释相结合仍然至关重要。随着空间多组学发展，建立标准化、层次化的空间微环境定义对于生成可重复的见解并将微观分子事件与宏观组织病理学联系起来至关重要。
#### 3.3 Other limitations
##### 3.3.1 Cybersecurity
处理空间组学数据带来了IT和网络安全挑战，原因在于其规模和体量巨大。这些技术生成高度异质的数据（从测序到高分辨率成像），每种数据有专属的生成和处理机制，产生本质上不兼容的文件格式、元数据模式和空间坐标。此外，它们采用从本地服务器到云存储的不同数据存储方案，并构建了自动化细胞分割和图像分析的生态系统。在这种情况下，仅整合数据并防止数据碎片化就成为一项艰巨的IT挑战，需要实施灵活以适应未来创新的新型基础设施。分析和整合多组学数据需要基于云的高性能计算（HPC）环境，具有可扩展架构以执行GPU和RAM密集型任务（如构建图网络、细胞分割、多模态数据整合）。同时，基于云的HPC还提供版本控制和来源追踪，这是高维数据分析过程的关键方面。整合和分析这些数据也引发了保护患者元数据的网络安全问题，需要严格的安全措施，如受控访问、安全API控制和HPC上的证书认证。若未实施零信任原则，应特别关注与不安全的S3兼容存储、API令牌泄露以及网络横向数据移动相关的问题。保护这些数据集需要多层策略，结合静态和传输中的加密、联合身份管理、硬件级安全模块、可审计日志记录以及严格的供应商合规框架。只有具备这些防护措施，空间组学数据才能在研究、临床和行业环境间高效共享，而不会损害患者隐私或分析结果的完整性。
### 4 Implications for immunocytokine engineering
通过改进技术QC和计算流程的空间多组学技术，免疫细胞因子工程有望在几个关键领域受益。
#### 4.1 Targeted delivery design
空间图谱揭示细胞因子受体表达模式，指导抗体-细胞因子融合蛋白中靶向结构域的选择。ECM靶向的L19-IL2设计说明了局部接合如何增强治疗效果并最小化全身扩散。高分辨率图谱（如Stereoseq）验证了受体富集微域作为优先接合位点。此外，QC驱动的微环境重建能够精确测量抗原表达细胞与细胞因子响应免疫细胞之间的细胞-细胞突触距离，为有效桥接提供连接子长度和灵活性的空间约束。相比之下，劣质QC可能扭曲空间关系和错误表征邻近性，导致次优靶向几何结构。
#### 4.2 Overcoming niche competition
空间转录组学揭示免疫细胞因子必须规避的细胞因子汇（cytokine sinks），包括Treg密集区域、CAF介导的排斥区和抑制性髓系簇。蛋白酶可激活的IL-12类似物（masked IL-12Fc）将活性限制在蛋白酶丰富的肿瘤环境中，改善了治疗指数并限制了系统毒性。通过稳健QC最小化转录本丢失，空间数据集还能解析非靶组织中的低水平受体表达，改善脱靶汇责任的预测。此外，准确的空间分辨率揭示了调节元素，如诱饵受体或清除受体（scavenger receptors），这些元素调节细胞因子可用性和信号传导，使工程策略能够避免隔离并保持细胞因子活性。
#### 4.3 Selecting novel cytokine targets
空间分泌组分析识别在特定CAF-免疫界面富集的非经典细胞因子（如IL-33、CXCL12），这些可被纳入下一代免疫细胞因子载荷中。关键是，依赖于QC改进的分辨率和分割，允许区分真正的细胞间信号传导与来自相邻细胞的技术性串扰（bleed-through），确保识别的配体-受体相互作用反映生物学上相关的通信网络，适合治疗性开发。
#### 4.4 Region-specific efficacy profiling and dosing
细胞因子暴露（如IL-12细胞因子工厂）后的空间重塑定义了应靶向持续活性的区域。检查点抑制剂后的定时给药可能放大治疗前不存在的效应微环境。高质量的QC进一步能够定量评估目标密度和亚细胞定位，区分膜可及靶点与细胞内池。这些测量指导亲和力优化：在高目标密度微环境中，低亲和力设计可利用亲合力优先结合致密的病理区域；在低目标密度微环境中，可能需要更高亲和力或多价格式以确保足够的细胞因子递送。
#### 4.5 Case study: L19–IL2 in PDAC
一项关于胰腺导管腺癌（PDAC）的研究阐明了这种影响。研究人员调查了免疫细胞因子L19-IL2（通过靶向EDB-纤连蛋白的L19抗体将IL-2选择性递送至肿瘤）的疗效。采用Stereoseq绘制治疗后TME中的免疫细胞浸润和激活。空间分析显示，L19-IL2通过将CD8
+ T细胞、NK细胞和抗原呈递细胞招募到肿瘤核心，同时上调IL-2受体基因和细胞毒性标志物（如颗粒酶、穿孔素），将免疫学“冷”肿瘤重塑为“热”肿瘤。这些发现由Stereoseq聚类和热图验证，展示了空间转录组学如何揭示批量RNA-seq无法解析的局部免疫激活模式。
### 5 Conclusion
空间多组学——在严格QC和深思熟虑的计算框架基础上——提供了一种机制性视角，以前所未有的清晰度审视肿瘤的免疫结构。这种空间生物学与免疫细胞因子工程的整合代表了一种变革性转变：现在可以设计疗法来利用、重塑或重新编程定义的免疫生态系统，而非依赖全身性细胞因子暴露。将空间知情原则嵌入细胞因子治疗开发将加速创建靶向性更强、更安全且更有效的免疫细胞因子疗法，这些疗法能够重塑TME并改善患者预后。
