《Frontiers in Immunology》：Low-dose multi-walled carbon nanotubes are non-inflammatory alone but amplify lipopolysaccharide-induced cytokine responses in A549 lung epithelial spheroids
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背景：空气污染物包含生物制剂如脂多糖（LPS）和工程纳米材料，包括碳纳米管（CNTs），其在工业和消费品应用中日益普遍。虽然高剂量CNT暴露的肺毒性已明确，但低剂量、非细胞毒性CNT暴露的炎症后果，特别是与其他气溶胶联合暴露时，仍知之甚少。方法：研究人员研究了
背景：空气污染物包含生物制剂如脂多糖（LPS）和工程纳米材料，包括碳纳米管（CNTs），其在工业和消费品应用中日益普遍。虽然高剂量CNT暴露的肺毒性已明确，但低剂量、非细胞毒性CNT暴露的炎症后果，特别是与其他气溶胶联合暴露时，仍知之甚少。方法：研究人员研究了三维（3D）A549人上皮球体中对多壁碳纳米管（MWCNTs）的细胞毒性和促炎反应，并与A549单层细胞和MM6单核细胞进行比较。细胞暴露于两种直径不同的CNT（CNT1：7–15 nm；CNT2：110–170 nm），单独或与LPS联合。细胞活力通过WST-1检测和F-肌动蛋白连接染色评估，而白细胞介素-8（IL-8）和白细胞介素-6（IL-6）的产生通过酶联免疫吸附试验（ELISA）和定量聚合酶链反应（qPCR）定量。结果：A549球体比单层细胞对CNT诱导的细胞毒性更敏感，其中CNT1诱导的细胞毒性大于CNT2。在非细胞毒性浓度下，单独的CNT不引发细胞因子释放；然而，与LPS共同暴露显著增强了球体中的细胞因子分泌，特别是在CNT2存在下。这种协同炎症反应在MM6单核细胞中未观察到。结论：该研究表明，非细胞毒性CNT可增强LPS驱动的A549上皮球体炎症，提示即使低剂量下，环境内毒素与纳米材料的联合暴露也可能存在呼吸风险。
**论文解读**
**研究背景与问题**
空气污染物包含多种生物制剂（如脂多糖，LPS）和工程纳米材料（如碳纳米管，CNTs），它们在工业和消费品中日益普及。高剂量CNT暴露的肺毒性已被证实，但低剂量、非细胞毒性CNT单独或与LPS联合暴露的炎症后果尚不明确。绝大多数体外研究采用中高浓度（20–100 μg/ml）CNT，而低浓度（≤1 μg/ml）常被认为无毒性且无炎症性。然而，职业和环境暴露常涉及颗粒物与生物制剂的复合物，而非单一刺激。此外，传统二维（2D）单层培养未能充分反映肺上皮的结构复杂性、细胞间相互作用及屏障功能，而三维（3D）培养系统（如球体）可更贴近体内组织架构。因此，本研究旨在评估低剂量多壁碳纳米管（MWCNTs）是否在非毒性条件下调节LPS诱导的促炎细胞因子反应。
**研究内容与结论**
研究人员采用两种不同直径的MWCNT（CNT1：7–15 nm，CNT2：110–170 nm），单独或与LPS（1 μg/ml）联合，暴露于3D A549人肺上皮球体、2D A549单层细胞及MM6单核细胞，检测细胞毒性、F-肌动蛋白连接、IL-8和IL-6的分泌与mRNA表达。主要结论：A549球体对CNT诱导的细胞毒性比单层更敏感，细直径CNT1毒性更强；非细胞毒性浓度（0.1–1 μg/ml）的CNT单独不引起细胞因子释放，但显著增强LPS诱导的IL-8和IL-6在球体中的分泌，且粗直径CNT2的增强效应更显著；这种协同炎症反应在MM6单核细胞中未观察到。该研究首次证明低剂量（亚微克级别）MWCNT可在共暴露条件下放大LPS驱动的上皮炎症，提示即使低浓度，环境内毒素与纳米材料的联合暴露也具潜在呼吸风险。论文发表在《Frontiers in Immunology》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用三维（3D）A549人肺上皮球体模型（旋转培养法形成直径50–100 μm球体），并与二维（2D）A549单层细胞（常规贴壁培养）及MM6单核细胞悬液进行比较。两种多壁碳纳米管（MWCNT）——CNT1（7–15 nm，Sigma-Aldrich #412988）和CNT2（110–170 nm，Sigma-Aldrich #659258）——经含1%牛血清白蛋白的培养基超声波分散后处理细胞，浓度0.1–100 μg/ml，单独或与LPS（1 μg/ml，E. coli 0111:B4）联合暴露24小时。细胞活力通过WST-1检测和F-肌动蛋白连接染色评估，细胞因子蛋白水平（IL-8、IL-6）采用ELISA定量，mRNA表达（IL8、IL6）采用qPCR检测（3小时处理后）。内毒素水平确认低于0.01 EU/ml。细胞来源：A549（美国典型培养物保藏中心，UK）、MM6（德国微生物和细胞培养物保藏中心，Braunschweig）。
**研究结果**
1. **CNTs在A549球体中诱导比单层更大的细胞毒性，且呈直径依赖性**
通过WST-1检测发现，LPS（1 μg/ml）不影响两种培养方式的细胞活力。在单层中，仅细直径CNT1在100 μg/ml时显著降低活力，粗直径CNT2无毒性；而在球体中，CNT1在5 μg/ml、CNT2在100 μg/ml时即引起毒性，且F-肌动蛋白免疫荧光显示细胞连接随CNT1浓度（0.1–10 μg/ml）增加而逐渐破坏，5 μg/ml时已观察到连接异常但未显著影响细胞活力。
2. **非细胞毒性CNT剂量不诱导IL-8或IL-6产生，但增强A549球体中LPS诱导的细胞因子反应**
选用非细胞毒性浓度（0.1–1 μg/ml）CNT进行后续实验。WST-1验证联合暴露不影响球体活力。ELISA结果显示，CNT1或CNT2单独均未诱导IL-8或IL-6分泌；但与LPS联合后，IL-8和IL-6分泌显著高于LPS单独处理组。CNT1（1 μg/ml）增强IL-8，CNT2（0.1–1 μg/ml）增强IL-8，且仅CNT2在0.5 μg/ml增强IL-6。qPCR结果印证：CNT1（1 μg/ml）+LPS和CNT2（0.5 μg/ml）+LPS处理后3小时，IL8和IL6 mRNA表达均显著高于LPS单独处理。
3. **非细胞毒性CNT剂量对MM6单核细胞的基础或LPS诱导的细胞因子产生无影响**
WST-1检测显示，在MM6单核细胞中，CNT1和CNT2在≥50 μg/ml时显著降低活力，且无直径依赖性差异。在非细胞毒性CNT浓度（0.1–10 μg/ml）下，单独或联合LPS处理24小时后，ELISA检测IL-8和IL-6分泌，发现LPS单独即强烈诱导两种细胞因子，但CNT单独或联合LPS均未改变其分泌水平。
**讨论与结论**
讨论指出，亚微克浓度的MWCNT（0.1–1 μg/ml）虽本身无细胞毒性且不直接促炎，但可增强LPS诱导的A549球体上皮细胞因子反应（IL-8、IL-6），且该增强效应取决于CNT直径——粗直径CNT2（110–170 nm）尽管毒性较低，却产生更大的协同放大作用。相比之下，MM6单核细胞虽对LPS反应强烈，但非毒性CNT并未增强LPS应答，提示该协同效应可能具有肺泡上皮特异性。研究还观察到低剂量CNT破坏F-肌动蛋白连接而不显著降低活力，但未直接评估屏障功能。推测可能的机制包括CNT吸附LPS、增强配体呈递或TLR4模式识别受体聚集，以及细胞外/膜相关相互作用。但本研究的局限性包括：仅测试两种不同直径的MWCNT，未涵盖其他长度或表面化学；仅评估LPS一种共暴露刺激；A549球体为癌细胞来源，不能完全代表原代人气道上皮表型和免疫信号；MM6为白血病来源的单核细胞样模型；且协同机制尚未探究。
**结论部分翻译**
总之，在测试条件下，亚微克水平的MWCNT增强LPS诱导的A549球体上皮炎症反应，而不显著影响细胞活力。这些来自3D A549球体模型的发现，提供了对CNT-LPS共暴露条件下上皮反应的见解，并强调了评估纳米材料与微生物联合暴露的重要性。尽管具有参考价值，但这些结果需要在更生理相关的体外系统（如极化多细胞模型、气液界面培养或精密切片肺切片）及体内研究中加以证实。通过在此可重复的上皮系统中定义这些反应，该研究为未来探究更多CNT类型、多种共暴露以及更生理条件下CNT-LPS相互作用的分子机制奠定了基础。
