犬外周血单个核细胞来源先天淋巴样细胞的鉴定、表征与扩增

《Frontiers in Immunology》：Identification, characterization, and expansion of innate lymphoid cells derived from canine peripheral blood mononuclear cells

　　

先天淋巴样细胞（innate lymphoid cells，ILCs）是一类具有淋巴系来源的先天免疫细胞，作为组织损伤和炎症的第一反应者发挥作用。该类细胞在哺乳动物抵御肿瘤生长过程中具有关键作用。ILCs能够在器官间迁移、在组织内移动，并在炎症期间由血液补充。尽管人和小鼠中关于ILCs的认识已较为丰富，但犬ILCs的特性仍在很大程度上未明。为表征犬ILCs，研究人员分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）并进行培养以扩增ILCs。PBMCs采用重组人白细胞介素-2（recombinant human interleukin-2，rhIL-2）和重组犬白细胞介素-7（recombinant canine interleukin-7，rcIL-7）刺激以扩增ILC1s，采用rcIL-33扩增ILC2s，或采用rh/rcIL-23扩增ILC3s。采用流式细胞术（flow cytometry）对PBMCs及培养体系中的ILCs进行鉴定。结果表明，新鲜PBMCs中存在彼此不同的ILC1s、ILC2s和ILC3s群体，其特征为表达细胞表面标志物（Lin^?、CD45⁺、CD127⁺）以及亚群特异性转录因子T-bet⁺（ILC1s）、GATA-3⁺（ILC2s）和RORγt⁺（ILC3s）。在第0、7、14和21天进行扩增后，各ILC亚群纯度均升高，并在第14天达到峰值。扩增后的ILCs上调了亚群特异性转录因子，提示其发生了分化与富集。上述发现提供了一种从血液中分离、表征并扩增犬ILCs的可靠方法，可用于研究其在健康、疾病及潜在治疗中的作用。由于犬发生癌症的方式与人类相似，该研究亦为人类肿瘤研究提供了参考。

该文发表于《Frontiers in Immunology》，聚焦犬先天淋巴样细胞（innate lymphoid cells，ILCs）的鉴定、表型界定与体外扩增，旨在弥补犬免疫学中ILC研究基础薄弱的关键空白。ILCs是淋巴系来源但不依赖抗原特异性受体识别的先天免疫细胞，在组织稳态维持、炎症调控、黏膜防御以及肿瘤免疫中具有重要作用。现有人和小鼠研究已将ILCs分为ILC1、ILC2和ILC3等主要亚群，并依据谱系排除标志、CD127以及亚群特异性转录因子和效应细胞因子加以识别。然而在犬中，除自然杀伤（natural killer，NK）细胞相关研究稍多外，其他ILC亚群的表型特征、分布及扩增条件仍缺乏系统性描述。由于犬能够自然发生与人类高度相似的肿瘤和免疫介导性疾病，建立犬ILC研究体系不仅对兽医免疫学有基础意义，也对比较免疫学和转化医学具有潜在价值。正是在这一背景下，研究人员开展了本研究，试图建立一套可重复的犬外周血ILC识别与扩增流程。

本研究首先围绕犬外周血中是否存在可分辨的ILC亚群这一核心问题展开。由于犬缺乏经充分验证的ILC谱系特异性抗体，研究人员采用基于排除法的流式细胞术（flow cytometry）策略，将T细胞、B细胞及髓系细胞相关标志物CD3、CD5、CD21和CD11b阳性细胞排除，在CD45⁺白细胞中界定Lin^?CD127⁺群体作为总ILCs，再结合转录因子T-bet、GATA-3和RORγt分别识别ILC1、ILC2和ILC3。研究结果显示，健康犬新鲜外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）中确实存在频率极低但可检测的ILC1、ILC2和ILC3群体。这一发现确认了犬外周循环中存在与人和小鼠相对应的ILC亚群，为后续功能研究奠定了细胞学基础。

在此基础上，研究人员进一步建立细胞因子支持的体外扩增体系，以克服循环ILCs基线丰度过低这一技术障碍。针对不同ILC亚群，研究分别设置了差异化细胞因子组合：ILC1培养条件为rhIL-2与rcIL-7，ILC2为rhIL-2、rcIL-33与rcIL-7，ILC3为rh/rcIL-23、rcIL-7与rhIL-2，并于第0、7、14、21天进行连续检测。结果表明，三类ILC亚群在细胞因子支持下均可发生显著扩增，其频率和绝对数量相对于新鲜PBMCs明显增加，且总体上在第14天达到最稳定、最一致的峰值。这说明特定时长的细胞因子支持培养对于最大化犬ILC富集至关重要。与此同时，扩增后的细胞中T-bet、GATA-3和RORγt表达增强，提示扩增过程不仅提高了数量，也促进了亚群相关转录程序的富集和维持。

就研究设计而言，作者采用的主要技术方法包括：从Ontario Veterinary College（OVC）社区招募健康成年犬，采集颈静脉外周血并分离PBMCs；利用密度梯度离心获取单个核细胞；采用多参数流式细胞术结合FMO（fluorescence minus one）对照建立Lin^?CD45⁺CD127⁺门控策略，并通过胞内转录因子染色识别ILC1、ILC2和ILC3；构建细胞因子驱动的体外扩增培养体系，在第0、7、14、21天比较不同亚群的扩增效率，并结合每毫升外周血PBMC产量计算ILC亚群绝对数量。该部分方法学核心在于“排除性表型定义+转录因子分型+细胞因子体外扩增”的整合流程。

以下结合原文结果小标题，对研究发现进行概括。

3.1 Results
该部分首先指出，犬ILC各亚群不仅能够在外周血中被检测到，而且能够通过流式细胞术可靠识别并在离体条件下有效扩增。研究人员在初步时间序列评估中观察到，ILC1、ILC2和ILC3从第7天到第14天均出现明显增加，尽管供体间存在一定差异，但第14天是三种亚群最一致的扩增高峰，因此被选为后续标准检测时间点。在纳入18只犬后续阶段分析时，所有下游比较均以新鲜分离细胞（第0天）和细胞因子支持培养14天后的细胞为对象。

在门控策略方面，研究通过FSC/SSC圈定淋巴细胞群，排除死细胞和双ts，再在CD45⁺白细胞中排除CD3、CD5、CD21和CD11b阳性细胞，最终将Lin^?CD127⁺群体定义为总ILCs。随后依据T-bet⁺、GATA-3⁺和RORγt⁺分别界定ILC1、ILC2和ILC3。通过这一策略，研究人员在新鲜PBMCs中检出了频率极低的犬ILC1、ILC2和ILC3。该结果说明，在缺乏犬特异性ILC抗体条件下，基于谱系排除联合CD127和关键转录因子的策略具有可行性。

在扩增结果方面，14天细胞因子培养后，ILC1、ILC2和ILC3在绝对数量和相对频率上均较新鲜PBMCs显著升高，并且在所有供体中均可观察到扩增趋势。尽管扩增幅度因个体而异，但三类亚群均能够在相应的细胞因子组合刺激下扩增。代表性流式图显示，扩增后各ILC亚群可依据转录因子表达形成清晰分离的群体，这进一步支持了犬ILC亚群被有效富集和表型化识别的结论。

3.2 Discussion
讨论部分围绕犬ILC表型界定的可靠性、现阶段局限性及其转化意义展开。首先，作者强调，本研究证明了犬外周血中存在可区分的ILC亚群，并可通过Lin^?CD127⁺结合转录因子表达加以识别。这一结果不仅扩展了犬免疫细胞图谱，也为比较免疫学研究提供了新的切入点。由于犬与人共享环境暴露，并会自然发生癌症及免疫介导性疾病，犬ILC研究可能帮助揭示跨物种保守的免疫调控机制。

其次，作者指出，犬ILC研究面临的主要挑战是缺乏经验证的谱系特异性抗体。因此本研究采用排除性门控而非直接阳性标记来定义ILCs。与此同时，作者也明确承认本研究未将细胞因子分泌功能作为ILC分类依据，而主要依据转录因子进行分型。传统上，ILC1、ILC2和ILC3的功能性界定分别依赖IFN-γ、IL-5/IL-13及IL-17/IL-22等细胞因子谱，但犬相关验证试剂有限，因此本研究选择以T-bet、GATA-3和RORγt作为主要分型依据。作者认为，扩增后这些转录因子稳定表达，支持犬ILC1、ILC2和ILC3的分类合理性。

作者还讨论了ILC2扩增效率相对较低的问题。尽管培养体系中已加入IL-33和IL-7，而二者被认为参与ILC2发育、稳定和GATA3表达调控，但犬GATA3最优表达是否还需要其他犬特异性细胞因子或辅助因素，仍有待进一步研究。该结果提示，不同犬ILC亚群对体外培养环境的依赖程度可能并不相同。

关于细胞因子跨物种活性，研究结果证明rhIL-2能够有效支持犬ILC培养，这与既往rhIL-2支持犬NK细胞生长的报道一致，也反映出现阶段犬免疫研究仍受限于物种特异性试剂不足。尽管如此，利用人源重组细胞因子实现犬ILC扩增，为后续研究其分化、生物学功能及免疫调节作用提供了实用平台。

作者还特别讨论了ILC1与常规NK（conventional NK，cNK）细胞区分的问题。由于两者在T-bet表达、细胞毒性介质和IFN-γ等方面存在重叠，而犬中可用于明确区分二者的验证标志物有限，因此本研究定义的Lin^?CD127⁺T-bet⁺群体虽符合ILC1特征，但与cNK的部分重叠尚不能被完全排除。这一限制提示未来需要结合更多表型标志和转录组学方法进一步细化犬ILC1定义。

总体而言，本文的意义主要体现在三个层面。其一，建立了从犬血液中识别和扩增ILC亚群的可重复方法学框架。其二，证明犬外周血中存在与人和小鼠相对应的ILC1、ILC2和ILC3样群体，推动犬先天免疫细胞谱系研究向前发展。其三，为犬作为肿瘤、特应性皮炎及其他免疫介导性疾病转化模型的应用提供了细胞学基础，有助于后续开展肿瘤微环境、炎症、组织修复和过敏反应中的ILC机制研究。

研究结论部分可译述如下：研究结果表明，为最大化ILC群体富集，必须采用特定的细胞因子支持培养周期，这为包括癌症和特应性皮炎在内的下游疾病建模应用提供了实用平台。该体系能够分析亚群特异性效应程序、细胞因子应答以及其与肿瘤相关微环境中其他免疫细胞的相互作用。此外，鉴于犬日益被视为研究免疫介导性疾病和癌症的重要模型，此处所描述的方法使炎症、组织修复、过敏和肿瘤免疫中的ILC介导机制研究成为可能。总体而言，该研究建立了一种从血液中分离并扩增犬ILC亚群的可靠方法，为未来机制研究以及兽医和比较医学肿瘤学领域中基于ILC的诊断、预后或治疗策略开发提供支持。更重要的是，由于犬与人类免疫介导性疾病存在相似性，解析并扩增犬ILC亚群的能力为将犬作为研究免疫调控和疾病机制的转化模型奠定了基础。