血浆内皮微泡来源的circRNA 0006222在血管老化和颈动脉粥样硬化中的生物标志物价值

《Frontiers in Neuroscience》：Biomarker value of plasma endothelial microvesicle-derived circRNA 0006222 in vascular ageing and carotid atherosclerosis

　　

摘要
背景：携带环状RNA（circRNAs）的内皮微泡（EMVs）已成为衰老相关疾病的新型生物标志物。本研究探讨了血浆EMVs-circ_0006222作为血管老化（VA）和颈动脉粥样硬化（CAS）生物标志物的潜力。
方法：采用circRNA微阵列芯片筛选来自CAS参与者、VA参与者和健康对照者血浆EMVs中差异表达的circRNAs。根据内膜厚度评估VA，并通过计算机断层扫描血管造影（CTA）评估CAS。通过qRT-PCR测定血浆EMVs-circ_0006222水平。比较不同年龄和不同CAS严重程度患者的EMVs-circ_0006222水平。采用多变量逻辑回归和受试者工作特征（ROC）曲线分析评估EMVs-circ_0006222的诊断潜力。
结果：本研究共纳入47名健康对照者、81名VA参与者和216名CAS参与者。观察到血浆EMVs-circ_0006222水平与年龄呈负相关。在老年参与者以及VA和CAS参与者中，血浆EMVs-circ_0006222水平显著降低；此外，在CAS组中降低最为明显。与轻度和中度CAS受试者相比，重度CAS患者的血浆EMVs-circ_0006222水平下降。通过多变量逻辑回归分析，血浆EMVs-circ_0006222水平被确定为VA和CAS的显著独立危险因素。血浆EMVs-circ_0006222诊断VA和CAS的ROC曲线下面积分别为0.628和0.773。
结论：血浆EMVs-circ_0006222可能作为VA和CAS的有前景的生物标志物。

**论文解读：血浆内皮微泡来源的circRNA 0006222在血管老化与颈动脉粥样硬化中的生物标志物价值**

**研究背景与问题**

颈动脉粥样硬化（CAS）是缺血性中风的主要病因之一，在疾病初期和加重阶段往往呈潜伏和无症状状态，约18%–25%的缺血性中风可归因于CAS。早期CAS以颈动脉内膜-中膜厚度（IMT）增加为标志，而晚期则表现为动脉僵硬度增加、颈动脉斑块形成及管腔狭窄。这些特征与血管老化（VA）密切相关，VA被认为是CAS的危险因素。目前，IMT主要通过彩色多普勒超声（CDS）和计算机断层扫描血管造影（CTA）评估，但两种技术均存在局限性：CDS受骨骼影响可能降低图像质量和诊断准确性；CTA使用的放射性造影剂可能带来肾病和过敏反应等风险，且易受金属伪影干扰。此外，CDS和CTA的检查者依赖性可能导致结果不一致。因此，探索基于血液的生物标志物以评估VA和CAS可能是一种更个性化的策略。现有生化指标如中性粒细胞-淋巴细胞指数、血小板-淋巴细胞指数和细胞外基质金属蛋白酶虽对动脉粥样硬化事件具有预测价值（AUC 0.67–0.79），但这些指标可能受其他炎症或血液学状况影响。因此，研究人员旨在寻找对VA和CAS具有更高诊断效能且更客观的生物标志物。

内皮功能障碍是动脉粥样硬化病理生理的关键介质，可驱动年龄相关的动脉僵硬度增加，损害动脉功能，加剧脉动性血流动力学应激，并进一步加速颈动脉粥样硬化斑块形成。内皮微泡（EMVs）由激活或凋亡的内皮细胞释放，在临床症状出现前即可在循环中检测到升高水平，且携带来自亲代细胞的多种RNA（如mRNA、miRNA和circRNA），这些RNA分子在囊泡结构中高度稳定，可抵抗循环RNase的降解。多项研究表明，EMVs及其RNA载荷可反映早期内皮激活和损伤，因此是血管病理学的有前景指标。然而，EMV衍生的circRNA在VA和CAS发病机制中的具体作用尚未明确。在前期研究中，circRNA微阵列结果显示VA和CAS参与者血浆EMVs-circ_0006222水平降低，基因预测表明其潜在靶基因是去SUMO化酶——sentrin特异性蛋白酶1（SENP1），SENP1参与脂质代谢、心血管功能、氧化应激和炎症调节。因此，研究人员假设EMVs-circ_0006222可能成为CAS和VA的潜在生物标志物。本研究旨在通过临床外周血样本，探讨血浆EMVs-circ_0006222水平与VA和CAS的相关性，为早期检测和理解VA和CAS提供新视角。该论文发表在《Frontiers in Neuroscience》。

**主要关键技术方法**

本研究采用以下关键技术方法：1）**circRNA微阵列芯片**：用于筛选血浆EMVs中差异表达的circRNAs（样本量：n=3/组，来自健康对照、VA参与者和CAS参与者）；2）**EMVs分离与表征**：通过连续离心和免疫磁珠富集（使用抗CD105和抗CD144抗体）分离循环EMVs，并通过纳米颗粒追踪分析（NTA）、透射电子显微镜（TEM）和蛋白质印迹法（检测Annexin V）表征其大小、浓度和形态；3）**qRT-PCR**：使用TRIzol结合miRNeasy Mini Kit提取RNA，以U6为内参，通过2^-△△Ct法测定血浆EMVs-circ_0006222水平；4）**多变量逻辑回归和受试者工作特征（ROC）曲线分析**：评估EMVs-circ_0006222对VA和CAS的诊断价值。样本队列来源于2021年9月至2023年10月在广东医科大学附属医院招募的受试者，共纳入47名健康对照、81名VA参与者和216名CAS参与者。

**研究结果**

**3.1 研究人群的一般特征**：VA和CAS患者的年龄、收缩压（SBP）、舒张压（DBP）、同型半胱氨酸（HCY）和甘油三酯（TG）显著高于健康对照。三组间性别、葡萄糖（GLU）、胆固醇（CHOL）和脂蛋白磷脂酶A（LPA）无差异。高血压和糖尿病病史比例存在显著差异。

**3.2 分离的EMVs的确定**：通过NTA和TEM表征，分离的EMVs粒径分布在100–700 nm之间，免疫印迹证实Annexin V（微泡标志物）的存在。

**3.3 循环EMV-circRNAs的分布与多样性**：通过高通量转录组测序，在VA和CAS参与者中鉴定出183个共同差异表达的circRNA（与健康对照相比，115个下调，68个上调）。qRT-PCR验证显示，EMVs-circ_0006222在VA和CAS组中水平显著降低，与测序结果一致。

**3.4 血浆EMVs-circ_0006222与年龄负相关**：与年轻和中年参与者相比，老年参与者血浆EMVs-circ_0006222水平显著降低（p<0.001）。在所有参与者中，EMVs-circ_0006222与年龄呈显著负相关（r=-0.562, p<0.001）。在健康对照、VA和CAS三组中，EMVs-circ_0006222水平均随年龄增加而下降。

**3.5 VA和CAS组血浆EMVs-circ_0006222浓度显著降低，重度CAS组降低更明显**：与健康对照相比，VA和CAS组血浆EMVs-circ_0006222水平显著降低（p=0.049和p<0.001），CAS组较VA组降低约6倍（p<0.001）。在不同年龄亚组分析中，中老年组中VA和CAS患者的EMVs-circ_0006222水平显著低于健康对照。此外，随着CAS严重程度增加（轻度、中度、重度），EMVs-circ_0006222水平显著递减（各组间比较p<0.01）。

**3.6 血浆EMVs-circ_0006222是VA和CAS的独立且有利的诊断生物标志物**：多变量逻辑回归分析显示，年龄、SBP、GLU和EMVs-circ_0006222与VA相关；年龄、SBP、GLU、HCY和EMVs-circ_0006222与CAS相关。EMVs-circ_0006222的OR值均为0.19（95% CI: 0.12–0.31和0.11–0.33），表明其为保护因素。ROC曲线显示，EMVs-circ_0006222诊断VA的AUC为0.628（敏感性76.8%，特异性54.3%），诊断CAS的AUC为0.773（敏感性75.8%，特异性73.2%），诊断阈值分别为1.51 nmol/L和0.639 nmol/L。

**总结与讨论**

研究结论部分翻译：研究人员的发现表明，血浆EMVs-circ_0006222在VA和CAS中表达下调。血浆EMVs-circ_0006222在VA和CAS的诊断中展现出相当大的潜力。

讨论部分总结：本研究首次报道了血浆EMVs-circ_0006222水平在VA和CAS患者中与年龄呈负相关且显著降低，降低程度在老年患者和重度CAS患者中更为明显。EMVs-circ_0006222被确定为VA和CAS的独立因素，并具有诊断价值。该研究填补了EMV-circRNA作为VA和CAS生物标志物的空白。EMVs由内皮细胞释放，在炎症刺激、氧化应激和凝血障碍下显著增加，而circRNA因其高稳定性和细胞类型特异性，成为理想的生物标志物。生物信息学分析揭示SENP1是circ-0006222的靶基因，SENP1在心血管疾病、炎症和衰老中发挥重要作用。研究结果提示，EMVs-circ_0006222可能通过作为miRNA海绵竞争性结合SENP1 mRNA转录本，影响miRNA-mRNA相互作用。然而，本研究存在局限性，如EMVs-circ_0006222在血管损伤中的作用机制尚需进一步探索，未来需要更大规模、多中心队列研究来验证其在不同种族和临床亚组中的效用。