综述：超越亚群：单细胞转录组学揭示iNKT细胞跨组织和物种的多维调控

《Frontiers in Immunology》：Beyond subsets: single cell transcriptomics reveals multidimensional regulation of iNKT cells cross tissues and species

　　

恒定自然杀伤T（iNKT）细胞是先天性样淋巴细胞，快速响应由CD1d呈递的脂类抗原或炎症细胞因子，并影响多种免疫反应。研究人员当前对iNKT细胞生物学的理解主要来自小鼠研究，这些研究建立了胸腺分化为NKT1、NKT2和NKT17亚群的框架。最近的单细胞RNA测序（scRNAseq）研究通过揭示非线性发育轨迹、早期表观基因组启动以及一个在胸腺迁出后继续分化的多能近期胸腺迁出细胞群体，极大地扩展了这一观点。在外周组织中，iNKT细胞经历由局部环境线索和抗原暴露驱动的广泛重塑，产生在胸腺中未观察到的调节性和效应性状态。同时，新兴的人类研究揭示了与小鼠描述不同的原理。人类iNKT细胞表现出混合的1型/17型转录程序，有限的NKT2样群体证据，以及功能上不同的CD4⁺、双阴性（DN）、CD8αα⁺和终末效应样亚群。跨物种的比较分析进一步表明，胸腺选择、转录因子网络和外周成熟的差异导致了iNKT细胞特化的不同模式。总之，这些证据支持对iNKT细胞的修正观点，即它们是由发育历史、组织环境、抗原暴露和物种特异性调控程序塑造的动态且上下文依赖的转录状态。

引言（Introduction）
恒定自然杀伤T（iNKT）细胞是进化上保守的先天性样T淋巴细胞，处于先天性和适应性免疫的交界处。与常规αβ T细胞不同，iNKT细胞表达半恒定T细胞受体（TCR），小鼠为恒定Va14-Ja18链，人类为同源Va24-Ja18链，并与受限的TCRb链配对。该受体识别由非多态性MHC I类分子CD1d呈递的脂类抗原，使其能在刺激后迅速激活并产生大量细胞因子。通过与树突状细胞、巨噬细胞、B细胞、NK细胞和常规T细胞的相互作用，iNKT细胞影响抗微生物免疫、肿瘤监测、自身免疫、体液反应和组织稳态等过程。这些特性也使iNKT细胞成为即用型免疫疗法的有吸引力的候选者。对iNKT细胞生物学的大部分机制理解源于小鼠研究。在小鼠中，iNKT细胞在CD1d表达的双阳性胸腺细胞选择后，经历一系列明确阶段发育。早期研究基于CD24、CD44和NK1.1表达描述了线性成熟过程，随后通过功能分类补充了三个主要亚群——NKT1、NKT2和NKT17，分别由Tbet、PLZF/GATA3或RORgt表达以及优先产生IFNγ、IL-4或IL-17为特征。后续工作表明亚群分化可出现在中间阶段，且不同转录程序可能在终末成熟前启动，提示这些模型之间存在部分重叠。此外，iNKT细胞广泛分布于外周组织。目前尚不清楚外周iNKT细胞多样性在多大程度上反映了完全分化的胸腺亚群的播种，而非胸腺迁出后的持续分化和重塑。单细胞RNA测序（scRNAseq）通过揭示连续分化轨迹、过渡群体和组织特异性转录程序，完善了这一框架。这些数据挑战了僵化的亚群模型，并强调了胸腺后重塑的重要性。人类和比较转录组学研究的平行进展，通过识别分化和效应功能的保守特征及物种特异性特征，进一步扩展了我们对iNKT细胞生物学的理解。本综述讨论单细胞研究如何完善胸腺发育模型、揭示组织特异性重塑机制，并揭示跨物种iNKT细胞组织的重要相似性和差异。

胸腺基础：单细胞分析揭示的内容（Thymic foundations: what single cell analyses revealed）
在整合scRNAseq和单细胞ATAC测序（scATACseq）分析阶段分选的胸腺iNKT细胞时，Wang等人发现ST0区室内的异质性，并提出两个潜在发育轨迹：一条是从双阳性（DP）到CD4单阳性（CD4SP）的路径，与Zbtb16可及性增加和偏向iNKT2分化相关；另一条是从DP到双阴性（DN）的路径，与Rorc可及性和iNKT17分化特征相关。值得注意的是，在ST0阶段未检测到与iNKT1细胞相关的特征，提示iNKT1程序可能更晚获得。此前曾报道另一种发育途径：少量CD4^? NKT1细胞可直接来自DN胸腺细胞，绕过常规CD4⁺中间阶段。尽管这些发现提示亚群偏向可能在阳性选择后不久出现，但对ST0早期定向的解释仍需进一步研究。此外，该研究还识别出转录调控因子（包括Cbfβ）是早期iNKT细胞发育的重要贡献者。将观察扩展到人类，Loh等人报告大多数出生后胸腺iNKT细胞在转录上类似于常规T细胞的初始状态，特征为早期表达CCR9、TOX和SATB1，后期表达CCR7。这种初始样状态通过流式细胞术（CD161^?EOMES^?GZMK^?）得到确认，并在多种先天性样T细胞（Tinn，包括iNKT、黏膜相关恒定T细胞（MAIT）和γδT细胞）群体中共享。值得注意的是，仅少数Tinn表现出效应特征。跨物种分析显示小鼠以外的胸腺分化减少。在猪和人类中，iNKT细胞呈现更线性的发育轨迹，主要为未成熟表型，经典亚群分辨率有限。人类胸腺iNKT细胞富含SOX4、SATB1、LEF1、TOX2和ITM2A，这些基因在小鼠中与早期前体细胞和ST0细胞相关，并显示ZBTB16/PLZF高表达但TBX21或RORC表达最低。值得注意的是，SOX4调节子活性与整个分化轨迹的伪时间呈最强负相关，突显其在最早胸腺阶段的作用。与外周血数据集比较表明，更分化的亚群共享于胸腺和外周，而最未成熟的前体群体主要局限于胸腺。获得效应表型的人类胸腺iNKT细胞汇聚于混合型1/17转录状态，共表达EOMES和GZMK以及RORA和CCR6，而非小鼠中的TBX21和RORC。人类胸腺分化减少可能反映胸腺选择共刺激信号的物种特异性差异。在小鼠中，iNKT细胞成熟依赖于由SLAMF1和SLAMF6介导的DP胸腺细胞间同型相互作用，驱动PLZF上调。然而，在人类中，DP胸腺细胞上未检测到SLAMF6。此外，小鼠髓质胸腺上皮细胞（mTECs）表达CD1d，而人类mTECs不表达，将胸腺CD1d介导的抗原呈递主要限制于皮质胸腺上皮细胞（cTECs）和DP胸腺细胞。这些差异可能导致胸腺中不完整的效应iNKT细胞分化，进一步成熟可能推迟到外周组织。早期研究包括细胞因子报告和命运定位方法，将NKT2细胞确立为以高PLZF表达和组成型IL-4产生为特征的功能亚群。然而，最近scRNAseq研究一致将NKT2群体识别为转录上与前体样状态相关，一项研究报告NKT2与iNKT前体（NKTp）特征显著重叠，另一项则将NKT2解析为不同亚群（NKT2a和NKT2b）。在这两种情况下，轨迹推断将NKT2样群体置于导向NKT1和NKT17命运的发育路径的中间位置，转录组显示这些细胞内共表达谱系相关程序。这些发现提示NKT2细胞代表一个异质性群体，包括具有发育可塑性的细胞。同时，基于轨迹的分析受限于计算推断和快照数据，并不排除体内存在功能稳定的IL-4产生NKT2细胞。人类胸腺iNKT细胞的首次scRNAseq分析识别出一个富含小鼠NKT2特征的未成熟群体，而更分化的群体呈现NKT1样特征。然而，这些NKT2样细胞也在未成熟前体阶段表达发育调控因子，而非不同的效应谱系。与这一解释一致，后续分析在人类中未检测到表达IL-4或IL-13转录本的离散NKT2群体。另一个保守特征是存在富含干扰素刺激基因（ISGs）的iNKT群体，见于猪，类似于小鼠数据集中报道的ISG高表达iNKT群体。有趣的是，破坏I型干扰素信号优先损害iNKT1和iNKT17群体，支持干扰素信号在小鼠亚群分化中的作用。在人类中，在胸腺iNKT和MAIT细胞中均识别出类似的ISG相关簇，以MX1、IFI6和IFI44L为标志。ISG相关转录程序也见于外周iNKT细胞。胸腺效应Tinn细胞展示出与外周血细胞不同的组织特异性基因表达谱，反对ISG高表达胸腺细胞仅为血液来源污染物的解释。

胸腺后成熟：近期胸腺迁出细胞作为过渡状态（Post-thymic maturation: recent thymic emigrants as a transition state）
近期工作的一个关键启示是，胸腺迁出并未释放完全分化的iNKT效应亚群。实际上，成熟的胸腺NKT1、NKT2和NKT17细胞大部分是组织驻留的。联体共生实验显示，在共享循环30天后，>95%的胸腺iNKT细胞仍为宿主来源，胸腺内转移表明成熟NKT1细胞很少在脾脏中恢复。因此，胸腺和外周效应池基本独立，两者均来源于一个独特的CCR7⁺前体群体。Wang和Hogquist将此前体池识别为PLZF^hi细胞，区别于产生IL-4的NKT2效应细胞。在PLZF^hi iNKT细胞中，CCR7和PD-1区分前体与效应细胞，稳态下IL-4产生仅限于PD-1⁺细胞。CCR7⁺前体具有高度增殖能力，并在胸腺内或静脉内转移后产生所有三种效应亚群，表明在胸腺内外均具有发育潜能。在混合骨髓嵌合体中，Ccr7缺陷细胞显示效应分化受损和定位至胸腺髓质的缺陷，而髓质中来自髓质胸腺上皮细胞的IL-15促进NKT1定向。使用胸腺内NHS-生物素标记的直接RTE追踪进一步证实，CCR7⁺ iNKT细胞在主动离开胸腺的细胞中富集并显示未成熟表型。这些细胞的迁出依赖于KLF2，其在CCR7⁺前体和RTE中选择性表达。在混合骨髓嵌合体中，Klf2缺陷导致胸腺积累和RTE明显耗竭，与KLF2通过转录激活S1pr1和Ccr7驱动迁出一致。单细胞分析进一步通过识别位于胸腺前体和成熟外周iNKT细胞之间的RTE样群体，完善了这一模型。这些细胞表达运输和迁出相关基因（Ccr7、S1pr1、Sell、Klf2），同时缺乏强烈的NKT1、NKT2或NKT17程序。进入外周组织后，它们逐渐获得驻留相关基因（Atf3、Cd244、Cd69、Fos、Jun）并下调循环特征。亚聚类显示早期组织特异性分歧，在脾脏（Lgals1、S100a6）、肝脏（Irf8、Xcl1）和淋巴结（Dapl1、Sell、Tsc22d3）中有不同特征，表明局部线索在播种后不久就开始塑造iNKT身份。KLF2在此过程中的重要性进一步由条件敲除研究支持：Klf2缺失阻断早期胸腺发育（阶段1-2）、降低CCR7表达，并严重耗竭脾脏、肝脏和肺中的外周iNKT细胞，同时保留淋巴结群体，提示部分KLF2非依赖性播种机制。一个未解决的问题是，是否表达Gzma/Ccl5并保留高Klf2和循环特征的细胞毒性簇代表过渡性RTE群体而非长效NKT1亚群。其在UMAP中与RTE簇的接近支持这种可能性，但其发育起源仍不清楚。

外周重塑：组织和抗原塑造iNKT细胞状态（Peripheral remodeling: tissue and antigen shape iNKT cell states）
单细胞分析揭示，iNKT细胞在胸腺迁出后经历广泛重塑，受组织特异性线索和抗原暴露塑造。
组织特异性对亚群分化的影响（Tissue-specific effects on subset divergence）
Wang等人提供了跨肝脏、脾脏和淋巴结的外周iNKT细胞系统单细胞图谱，并与胸腺群体整合。NKT1细胞显示出显著的组织依赖性分歧，在不同器官间形成基本独立的簇，器官间相关性低；而NKT17细胞汇聚成一个单一、高度相关的簇，表明对环境线索相对抵抗。不同组织中的NKT1细胞表现出环境特异性特征，包括肝脏中增强的存活和信号通路，淋巴结中更强的驻留和激活特征，而脾脏和肝脏中维持更多循环特征。这些发现扩展了Murray等人早期的批量RNA测序工作，后者显示iNKT细胞主要按亚群身份而非组织来源聚类，表明尽管存在组织驱动重塑，核心谱系程序仍得以保留。此外，干扰素刺激基因（ISG）高表达群体在外周器官中保守，具有强器官间相似性，并在人类中有保守证据，提示I型干扰素信号定义了一个组织非依赖性转录状态。尽管人类组织scRNAseq数据集仍然有限，早期研究表明胎儿肠道iNKT细胞获得比脾脏或淋巴结iNKT细胞更分化的表型，提示组织特异性成熟并非小鼠独有。
抗原驱动重塑以及调节性和记忆样状态的出现（Antigen-driven remodeling and the emergence of regulatory and memory-like states）
抗原暴露是外周iNKT细胞多样化的主要驱动因素，产生胸腺中缺失的激活状态。使用纵向scRNAseq分析αGalCer刺激后的脾脏和脂肪组织iNKT细胞，Kane等人定义了iNKT激活和分化的转录动态。早期激活（4小时）以快速诱导细胞因子程序、PLZF相关基因以及与糖酵解和生物合成相关的代谢通路为特征，而经典NKT1和NKT17特征被短暂抑制。值得注意的是，此早期激活程序在NKT1、NKT2和NKT17亚群中广泛保守，提示抗原驱动反应叠加而非擦除谱系相关程序。到72小时，细胞向增殖和记忆样状态过渡，以Tcf7、Slamf6、Ccr7、Klrg1、Itga4和Cxcr5表达为标志。亚群特异性代谢差异也出现，NKT2和NKT17细胞比NKT1细胞表现出更强的氧化磷酸化特征和线粒体活性。与此一致，氧化磷酸化抑制优先损害IL-4、IL-13和IL-17A产生，同时保留IFNγ，突出了激活亚群间不同的代谢需求。稳态下脂肪组织iNKT细胞也表现出独特的慢性激活表型，以Nr4a基因、Nfat家族成员、Cd69、Il2、Myc、Klrg1和Itga4表达升高为特征。单次αGalCer挑战后，脂肪组织iNKT细胞在72小时维持延长细胞因子表达，这是一种在脾细胞中未观察到的“闷烧”激活模式，与稳态下慢性内源性激活一致。有趣的是，脂肪组织中Il10表达主要限于NKT1样细胞，提示在此环境下NKT10细胞优先来自NKT1谱系。刺激后4周，多个组织中出现两个诱导群体。KLRG1⁺群体显示细胞毒性效应特征，类似于CD8效应记忆和NK细胞，包括Gzmb、Gzma、Klrd1、Cx3cr1和Zeb2表达。相比之下，cMAF⁺群体表现出与记忆、前体耗竭和Tr1样状态相关的转录特征，包括Il27ra、Ctla4、Lag3、Hif1a和Maf。这些群体互斥，在转录上更类似于NKT1而非NKT2或NKT17细胞。与此一致，产生IL-10的cMAF⁺细胞和表达颗粒酶的KLRG1⁺细胞均共产生IFNγ，而IL-17A和IL-10表达保持互斥。基因调控网络分析将cMAF识别为与Il10表达最强烈相关的转录因子，支持其在调节性iNKT程序中的核心作用。尽管cMAF⁺细胞与NKTfh细胞（包括Tox、Slamf6、Tcf7、Il21和Lag3表达）有大量转录重叠，但它们很少表达CXCR5或PD-1且缺乏BCL6，因此作者将其分类为不同于NKTfh细胞。值得注意的是，cMAF⁺和KLRG1⁺细胞的小群体在稳态下已存在于脂肪组织，与慢性内源性激活一致。重复αGalCer刺激同样在脾脏iNKT细胞中诱导脂肪组织样的调节性程序，包括Tr1相关特征和对应激激发的反应性降低，提示慢性激活汇聚于共享的调节性iNKT细胞状态。
人类外周iNKT细胞多样性（Human peripheral iNKT diversity）
与小鼠iNKT细胞相比，人类外周iNKT细胞与经典NKT1、NKT2和NKT17框架的一致性较低。早期表型研究识别出功能不同的CD4⁺、DN和CD8⁺ iNKT细胞群体，并提示以CD4、CCR7和CD62L丢失、NK相关受体（包括CD161、CD56和NKG2A）获得以及IFNγ表达增强为特征的成熟轨迹。对人类胎儿组织的研究表明，iNKT细胞优先在胎儿小肠中积累，在此获得更分化的表型和较低增殖能力，与胎儿脾脏和肠系膜淋巴结中的iNKT细胞相比。值得注意的是，这些变化发生在共生微生物群建立之前，提示组织特异性因子和内源性CD1d配体可在外周播种后塑造iNKT细胞状态。最近的scRNAseq研究显著完善了这一框架。对血液iNKT细胞的分析已识别出前体样CD62L⁺LEF1⁺群体、细胞毒性GZMB⁺GNLY⁺群体以及激活相关状态。对胸腺、脐血、外周血和骨髓的综合分析揭示，人类iNKT细胞经历前体、过渡和效应状态的发展轨迹。前体群体富含发育调控因子，包括SOX4、LEF1、TOX2和ITM2A，而分化的群体获得主导性Th1/17/NK样效应程序，共表达TBX21和RORC，以及GZMK、GZMA、KLRB1、GNLY、CCL5、CXCR4、IL18R1和IL18RAP，表明准备快速细胞因子驱动反应。值得注意的是，人类效应iNKT和其他Tinn细胞中GZMK而非GZMB占主导，而小鼠Tinn细胞依赖预先形成的细胞因子转录本实现快速反应，提示不同的效应机制。调控网络分析支持渐进分化模型。SOX4活性在前体群体中最高，并沿伪时间下降，而EOMES活性在分化细胞中增加，并与GZMK、NKG7、KLRG1、CCL4和LAG3的表达相关。连同RORA相关程序的富集，这些发现提示人类iNKT细胞分化依赖一个仅与小鼠中Tbet/RORgt控制程序部分重叠的转录网络。其他人类调控子包括MYBL1、CEBPD和FOSL2，进一步支持Tinn区室内存在物种特异性调控回路。最近分析中出现了两个额外群体。首先，一小部分终末分化的DN iNKT细胞表现出终末效应记忆RA阳性（TEMRA）样表型，特征为CD45RA重新表达、CCR7丢失以及细胞毒性基因（包括GNLY和KLRG1）富集。这些细胞类似于常规CD8⁺ TEMRA细胞，可能代表一种高度分化的效应状态，在胸腺中不明显。其次，人类CD8⁺ iNKT细胞解析为前体样和效应群体。值得注意的是，大多数外周CD8⁺ iNKT细胞表达CD8αα同源二聚体而非CD8αβ异源二聚体，将其与其他先天性样淋巴细胞群体在转录上联系起来，而非常规细胞毒性T细胞。在这些研究中，CD4和CD8表达仅与转录身份部分对应，表明基于共受体的分类未能完全捕捉人类iNKT细胞功能多样性。总之，当前证据支持一个模型，其中人类外周iNKT细胞沿发育和激活谱系组织，而非如小鼠中描述的离散效应谱系。主导效应状态结合了1型、17型和NK相关特征，而额外群体如TEMRA样和CD8αα⁺细胞进一步扩展了人类iNKT细胞区室的功能多样性。这些物种特异性特征在将小鼠模型洞见转化为人类iNKT细胞免疫疗法时应予以考虑。

讨论（Discussion）
此处回顾的scRNAseq研究支持一个模型，即iNKT细胞状态是动态且上下文依赖的，受发育阶段、组织微环境、抗原经历和物种特异性约束影响。虽然小鼠模型为不同谱系定向提供了基本洞见，但人类数据揭示了一个更渐进和可塑的过程，仅部分与小鼠范式重叠。在小鼠中，胸腺iNKT细胞迅速分化为不同的NKT1、NKT2和NKT17亚群，这些亚群在外周基本保留核心身份。然而，最近的scRNAseq数据强调NKT2样状态在导向NKT1和NKT17命运的轨迹中占据中间位置，并且抗原驱动重塑产生在胸腺中没有直接对应的长效外周亚群，包括调节性NKT10细胞、细胞毒性KLRG1⁺群体和NKTfh细胞。组织特异性重塑是明显的，特别是在NKT1细胞中，而NKT17细胞在器官间更保守。这些发现调和了强调亚群主导特征的批量RNA测序数据与亚群内异质性的单细胞分辨率。人类iNKT细胞比其小鼠对应物表现出更渐进的成熟轨迹，有证据表明发育阶段和衰老均影响iNKT细胞区室组成。在出生后胸腺中，大多数iNKT细胞呈现初始/前体样状态，类似于发育中的常规CD4⁺胸腺细胞，仅少数获得混合1型/17型效应特征。胎儿iNKT细胞已显示组织特异性功能成熟，在小肠中显著积累、CD161上调和强IFNγ产生，独立于共生菌群。脐血富集了具有高PLZF和前体特征的过渡群体，而成人外周血和骨髓逐渐倾向于CD4^? Th1/17/NK样效应细胞，以GZMK偏向的细胞毒性和先天细胞因子响应性为特征。同时，小鼠分析显示衰老重塑亚群稳态，NKT2区室逐渐收缩，而不从根本上改变核心iNKT细胞亚群程序，尽管确实出现了特定功能适应，包括NKT1细胞中颗粒酶A表达丢失、NKT17细胞中CD25上调以及增殖降低。在人类中，衰老与循环iNKT细胞频率显著下降相关，伴随CD4⁺亚群升高、DN亚群降低以及偏向Th2偏向细胞因子产生。抗原驱动重塑得到直接刺激实验的支持，这些实验显示快速诱导不同的细胞因子产生、细胞毒性和潜在调节性状态，以及从脐血到成人血液/骨髓的效应子逐渐富集，特别是外周效应子中识别出CD45RA⁺CCR7^? TEMRA样亚群，通常与常规T细胞中慢性重复抗原暴露相关。跨物种比较揭示保守和分歧特征。核心程序（PLZF驱动的先天性和效应能力）是共享的，但人类缺乏显著的2型区室，表现出更大的多功能性和可塑性，依赖不同的调控网络（例如沿伪时间突出的EOMES、CEBPD、MYBL1、FOSL2和下降的SOX4），并显示独特群体如CD8αα亚群（初始样和效应样）和TEMRA样状态。人类和猪中胸腺分化减少相对于小鼠，提示大量功能特化在物种间发育后期逐渐发生。这些差异告诫不要直接从小鼠模型外推，并强调以人类为中心的系统对机制洞见的价值。尽管取得了重大进展，但重要问题仍然存在，包括组织特异性重塑的分子基础、调节性和辅助样状态之间的发育关系，以及年龄和环境驱动的转变如何影响疾病易感性。尽管如此，将iNKT细胞视为动态转录状态的新观点具有明确治疗意义。未来策略可能不是靶向固定亚群，而是通过操纵控制体内状态转变的转录和表观遗传网络，将人类iNKT细胞引导至所需的细胞毒性、调节性或辅助程序。