肠道微生物群通过单细胞和空间多组学揭示在胶质母细胞瘤中诱导基因表达、RNA甲基化和代谢的免疫相关改变

《Frontiers in Immunology》：Gut microbiota induces immune-related alterations in gene expression, RNA methylation, and metabolism in glioblastoma revealed by single-cell and spatial multi-omics

　　

胶质母细胞瘤（GBM）是一种高度恶性的肿瘤，预后差且有效治疗选择有限。新兴研究表明，肠道微生物群可能通过肠-脑轴影响胶质瘤进展，但确切机制仍不清楚。在本研究中，研究人员采用了一种全面的多组学方法——包括单细胞转录组学、空间转录组学、宏基因组学、代谢组学和m⁶A-seq——来研究抗生素诱导的肠道微生物群失调如何影响小鼠模型中的胶质瘤进展。基因表达分析显示，抗生素处理小鼠（ABX处理小鼠）中出现了显著变化，包括与胶质瘤进展和免疫调控相关的关键基因Epha6表达降低和Tead1表达上调。空间转录组学和代谢组学分析揭示了ABX处理小鼠胶质瘤中甲硫氨酸水平降低，将肠道来源的代谢物变化与通过m⁶A甲基化的表观遗传调控联系起来。单细胞RNA测序进一步表明，AC样细胞比例增加、细胞间通讯中断以及EPHA和NRXN信号通路异常。这些发现突显了肠道微生物群、免疫信号和表观遗传修饰在塑造胶质瘤微环境中的相互作用。本研究增进了对胶质瘤生物学中肠-脑轴的理解，并提出EPHA通路作为肿瘤进展中免疫介导调控的有前景的生物标志物，从而为肠-脑轴在胶质瘤调控中的作用提供了新见解。

**论文解读：肠道微生物群通过单细胞与空间多组学揭示胶质母细胞瘤中基因表达、RNA甲基化及代谢的免疫相关改变**

**研究背景与问题**

胶质母细胞瘤（GBM）是最高度恶性的原发性脑肿瘤，中位生存期仅约15个月，现有治疗手段难以应对肿瘤细胞向周围脑组织的弥漫性浸润，且血脑屏障（BBB）限制了药物递送。尽管免疫检查点抑制剂和嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法等新兴策略显示出前景，但GBM的免疫抑制微环境和免疫逃逸能力严重削弱了其疗效。与此同时，肠道微生物群通过肠-脑轴与中枢神经系统的双向通讯网络正受到广泛关注。已有研究表明，肠道菌群失调可加剧胶质瘤进展，但具体分子机制，特别是如何通过免疫调控、代谢物变化及表观遗传修饰影响GBM，仍不清楚。本研究旨在利用多组学整合策略，系统解析抗生素诱导的肠道微生物群失调对GBM小鼠模型的影响，揭示潜在的分子通路与调控网络。

**研究人员开展的研究与主要结论**

研究人员构建了携带Hras^G12V和sh-p53的慢病毒诱导的GBM小鼠模型，对雌性C57BL/6J小鼠进行为期4周的广谱抗生素（ABX）处理诱导菌群失调，随后通过多组学分析（包括批量RNA-seq、单细胞RNA-seq、空间转录组学、代谢组学、宏基因组学及m⁶A-seq）全面探究肠道微生物群变化对胶质瘤基因表达、细胞组成、代谢和表观遗传的影响。研究得出以下核心结论：（1）抗生素处理导致胶质瘤中Epha6表达显著下调、Tead1上调，这些基因与肿瘤进展和免疫调控密切相关；（2）单细胞分析显示ABX处理后AC样细胞比例显著增加，提示肿瘤可塑性和免疫逃逸增强，同时EPHA和NRXN信号通路在细胞间通讯中出现紊乱；（3）空间代谢组学发现ABX组胶质瘤中甲硫氨酸水平降低，宏基因组学证实甲硫氨酸合成相关微生物（如Alistipes megaguti、Prevotella ruminicola、Lachnospiraceae bacterium XBD2001）的丰度与甲硫氨酸水平显著相关；（4）m⁶A-seq显示ABX处理导致m⁶A修饰峰总数减少，且Tead1和Epha6基因上的m⁶A修饰降低，提示肠道微生物群可能通过调控甲硫氨酸- S-腺苷甲硫氨酸（SAM）-m⁶A轴影响基因表达。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

**关键技术方法**

本研究整合了多种前沿技术：①**单细胞转录组学**（scRNA-seq），使用10X Genomics平台对GBM组织进行测序，通过Seurat和Harmony进行降维聚类，inferCNV分析拷贝数变异，CellChat构建细胞间信号网络；②**空间转录组学**，采用10X Visium平台对石蜡包埋的胶质瘤切片进行探针杂交，Space Ranger处理数据，揭示EPHA家族基因的空间表达模式；③**宏基因组学**，对粪便样本进行测序，评估抗生素处理后的微生物组成及其与代谢物的相关性；④**代谢组学**（血液样本）和**空间代谢组学**（组织切片），使用LC-MS/MS和MALDI-MSI成像分析代谢物分布；⑤**m⁶A-seq**，通过R包exomePeak2进行峰识别和差异分析，HOMER进行motif富集。所有小鼠（C57BL/6J雌性，6-8周龄）购自GemPharmatech Co., Ltd（江苏，中国），动物实验经广西医科大学伦理委员会批准。

**研究结果**

**2.1 抗生素处理诱导胶质瘤中基因表达的改变**：通过批量RNA-seq分析，发现ABX组与对照组之间存在大量差异表达基因（DEGs），其中Epha2、Epha6（显著下调）和Tead1（显著上调）变化最突出。GO和KEGG富集分析显示这些基因富集于NF-κB信号通路、细胞外基质（ECM）-受体相互作用等恶性相关通路。

**2.2 使用单细胞RNA测序分析ABX处理的GBM样本中的单细胞水平变化**：UMAP降维显示ABX处理后AC样细胞比例显著增加，提示免疫逃逸和肿瘤可塑性增强。inferCNV分析在OPC样、AC样和NPC样细胞群中鉴定出潜在的拷贝数变异（CNVs）。

**2.3 细胞间信号网络与基因表达变化**：CellChat分析构建了细胞间通讯网络，发现NRXN和EPHA信号通路在ABX处理后发生显著改变，特别是AC样细胞与NPC样细胞、内皮细胞之间的相互作用减弱，表明菌群失调可干扰细胞间通讯。

**2.4 胶质瘤中代谢物与基因表达的空间分布**：空间转录组学显示ABX组中EPHA家族基因（特别是Epha6）在胶质瘤区域显著下调，而Tead1上调。空间代谢组学揭示ABX组胶质瘤中甲硫氨酸分布减少，提示肠道来源代谢物可能调控胶质瘤表型。

**2.5 抗生素处理诱导GBM小鼠肠道微生物组的变化**：宏基因组学分析显示ABX组和对照组间差异代谢物富集于嘧啶、酪氨酸、组氨酸和视黄醇代谢通路。甲硫氨酸水平在两组间存在显著差异（P < 0.05），且与甲硫氨酸合成微生物（如Alistipes megaguti、Prevotella ruminicola、Lachnospiraceae bacterium XBD2001）的丰度呈显著相关。

**2.6 胶质瘤中m⁶A修饰峰分布与基序分析**：m⁶A-seq显示ABX组m⁶A在基因区域（尤其是5'UTR和CDS前端）的分布发生变化，基序高度相似但A碱基修饰偏好增强。Tead1和Epha6基因上的m⁶A修饰峰在ABX组减少，提示抗生素可能通过降低m⁶A水平调控这些基因。进一步利用CGGA数据库分析发现EPHA6表达与GBM预后和肿瘤分期显著相关。

**讨论与结论**

**讨论总结**：研究表明，抗生素诱导的肠道菌群失调可能通过免疫调控和表观遗传改变参与GBM进展。Epha6下调与Tead1上调分别与免疫逃逸和肿瘤生长/耐药相关，且EPHA信号参与肿瘤血管生成。单细胞分析揭示AC样细胞比例增加及NRXN/EPHA通路紊乱，支持肠-脑轴调控肿瘤异质性和进展。微生物代谢物（如甲硫氨酸）通过影响m⁶A修饰动态，尤其在Tead1和Epha6的3'UTR区域，提供了从肠道微生物到表观遗传调控的分子连接。研究指出m⁶A可作为微生物组与中枢神经系统之间的调控节点。然而，本研究存在局限性，包括抗生素的脱靶效应、缺乏机制验证、未使用人类临床样本验证以及多组学样本量有限。未来应结合粪菌移植（FMT）、无菌小鼠验证或微生物再定殖实验区分微生物群依赖性与抗生素直接效应。

**结论翻译**：我们的发现提供了有力证据，表明抗生素处理诱导的肠道菌群失调可能通过免疫调控和表观遗传改变参与GBM进展。肠-脑轴作为肠道微生物群与中枢神经系统（CNS）之间的双向通讯网络，在调控这些相互作用中发挥关键作用。抗生素诱导的失调导致先前已涉及肿瘤发生和免疫逃逸的基因Epha6下调，以及已知参与胶质瘤肿瘤生长和治疗耐药的基因Tead1上调。EPHA信号也与肿瘤血管生成有关，支持血液供应和肿瘤生长。EPHA和Tead1信号的这些改变可能增强胶质瘤细胞迁移和侵袭，促进肿瘤的侵袭性。这些结果表明，菌群失调可能通过调控关键信号通路和改变肿瘤微环境相互作用来参与胶质瘤进展。