生物信息学驱动的类风湿关节炎血管生成相关基因单细胞测序分析

《Frontiers in Immunology》：Bioinformatics-driven single-cell sequencing analysis of angiogenesis-related genes in rheumatoid arthritis

　　

目的：探讨类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）中血管生成相关基因及免疫细胞谱，并评估其与RA患者的临床相关性。方法：研究人员从公共数据库检索RA滑膜基因表达数据集（GEO），使用R进行差异基因及免疫浸润分析。从基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis, GSEA）数据库获取血管生成相关基因，利用受试者工作特征（Receiver Operating Characteristic, ROC）曲线基于RA滑膜中的表达识别诊断基因。使用DAVID和Metaspace数据库进行基因本体论（Gene Ontology, GO）功能及京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路分析。分析RA相关单细胞测序数据进行降维及细胞类型注释，识别核心基因。最后收集RA临床样本的外周血单个核细胞（Peripheral Blood Mononuclear Cells, PBMCs）进行实时荧光定量聚合酶链式反应（Quantitative Real-Time PCR, RT-qPCR）及临床相关性分析。结果：本研究识别出11个与RA滑膜及血管生成相关的核心基因。值得注意的是，IL10、E2F7和E2F8的诊断准确率相对较高。此外，研究人员观察到这些基因在HIF1和VEGFA等关键信号通路中显著富集。因此，研究人员确定HIF1、VEGFA、E2F7、E2F8和IL-10是导致RA相关血管生成的关键因素，其中HIF1信号通路的相关性显著。此外，研究表明多种免疫细胞类型，包括B细胞、浆细胞、T细胞、自然杀伤（Natural Killer, NK）细胞、单核细胞、巨噬细胞、静息树突状细胞、肥大细胞和中性粒细胞，均参与RA的发病机制。相关分析显示HIF1与IL10以及E2F7与E2F8呈正相关。然而，HIF1/VEGFA与常见差异免疫细胞群（如记忆B细胞、浆细胞和活化记忆CD4+T细胞）之间的关系普遍较低。进一步探索核心靶点的临床意义发现，RA患者中E2F7、E2F8、IL10、HIF1和VEGFA的mRNA水平显著高于健康对照组。其中，活动性RA患者中HIF1、VEGFA和E2F8的水平显著高于其他时期，其表达水平与疾病活动度呈正相关。相比之下，尽管缓解期RA患者中E2F7和IL10水平显著下降，但仍高于正常对照组。结论：该研究指出HIF1、VEGFA、E2F7、E2F8和IL-10是关键血管生成基因，其表达紧密反映临床疾病活动度。值得注意的是，HIF1、VEGFA和E2F8随严重程度增加同步升高，受炎性滑膜微环境塑造，并似乎促进血管生成和RA进展。

该研究发表于《Frontiers in Immunology》。研究背景方面，类风湿关节炎（Rheumatoid Arthritis, RA）是一种慢性系统性自身免疫病，主要表现为持续性关节炎症，导致关节肿胀、疼痛及功能受损，全球成人患病率约1%，女性为男性2至3倍。现有研究表明血管生成在RA发展中起关键作用，其过程由血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor, VEGF）等触发，缺氧诱导因子1（Hypoxia-Inducible Factor 1, HIF1）通过下游效应分子VEGFA促进内皮细胞活化，支持炎症关节高代谢需求，但血管生成相关基因（Angiogenesis-Related Genes, ARGs）在RA中的临床相关性尚未完全阐明，亟需识别生物学机制并发现靶向抗血管生成治疗的新生物标志物。

研究人员利用生物信息学工具分析大型遗传数据集，结合单细胞测序（Single-Cell Sequencing）分析，从GEO数据库获取RA滑膜基因表达微阵列数据集及单细胞RNA测序数据（GSE159117），通过R软件进行差异表达分析、共识聚类、Venn图交集分析、ROC曲线诊断价值评估、GO与KEGG富集分析、CIBERSORT算法免疫浸润分析、相关性分析及Seurat对象质控与t-SNE降维注释；临床验证部分收集宜昌市中心人民医院6例正常对照及12例RA患者外周血单个核细胞（PBMCs）进行RT-qPCR验证及临床指标（TJC、SJC、ESR、CRP、DAS28、RF、抗CCP抗体）相关性统计。

研究结果部分，差异表达分析显示GSE89408数据集中RA较健康对照有3306个上调及3052个下调基因，189个血管生成相关基因经共识聚类将RA分为RA1与RA2两亚型，交集分析获得CARD10、NGFR、CDH13、TEK、RHOJ、IL10、E2F7、E2F8、IL12B、FOXC2、TNN共11个共有基因，其中CDH13、TEK、RHOJ、IL10、E2F7、E2F8、IL12B在RA滑膜中表达升高。血管生成相关基因诊断价值分析显示IL10（AUC=0.936）、E2F7（AUC=0.905）、E2F8（AUC=0.874）诊断特异性较高。富集分析表明11个基因在生物过程（Biological Process, BP）中富集于内皮细胞增殖正向调节及芽生血管生成，细胞组分（Cellular Component, CC）富集于细胞外间隙，分子功能（Molecular Function, MF）富集于细胞因子活性及蛋白结合；KEGG通路显著涉及PI3K-Akt、JAK-STAT、Ras、MAPK、HIF1及Toll样受体通路，HIF1信号通路在缺氧促新生血管中起核心作用。免疫浸润分析显示RA组滑膜较正常对照在记忆B细胞、浆细胞、静息记忆CD4⁺T细胞、活化记忆CD4⁺T细胞、滤泡辅助T细胞、调节性T细胞（Tregs）、γδT细胞、静息NK细胞、活化NK细胞、单核细胞、M1巨噬细胞、静息树突状细胞、静息肥大细胞、中性粒细胞丰度上存在显著差异，RA1与RA2组间亦在多数上述细胞及初始CD8⁺T细胞、初始CD4⁺T细胞、M0巨噬细胞中差异显著。相关性分析显示HIF1与RA特异性血管生成基因IL10、E2F7、E2F8呈正相关，FoxO1、FoxO3、FoxO3B亦呈正相关但系数较低，FoxO4与VEGFA呈负相关；HIF1、FoxOs、VEGFA与免疫细胞相关系数普遍较低。单细胞数据过滤与表达显示GSE159117经质控过滤线粒体基因>5%及基因数<200或>2500的细胞后，RA样本nCount_RNA与nFeature_RNA均值及范围高于对照，percent.mt与nCount_RNA负相关（r=-0.31），nFeature_RNA与nCount_RNA强正相关（r=0.94），PCA显示RA与对照沿PC1、PC2轴明显分离。核心基因细胞类型注释显示t-SNE降维聚类后，HIF1与VEGFA在单核细胞及树突状细胞高表达，E2F7在单核细胞部分表达、E2F8普遍低且非特异表达，IL-10主要在单核细胞表达。RT-qPCR验证核心基因表达显示RA患者PBMCs中E2F7、E2F8、IL-10、HIF1、VEGFA mRNA水平显著高于健康对照；按DAS28分层后，活动性RA组HIF1、VEGFA、E2F8较缓解组显著升高且与疾病活动度正相关，E2F7与IL-10在活动组较缓解组显著降低但仍高于正常对照。临床相关性分析显示E2F7与临床指标弱相关，E2F8与抗CCP、ESR、CRP、TJC、SJC、PGA、DAS28强相关（r>0.5, P<0.05）且与DAS28最强（r=0.80, P<0.001）；VEGFA与DAS28强相关（r=0.67, P<0.01）；HIF1与DAS28强相关（r=0.71, P<0.01）；IL10与DAS28强相关（r=0.55, P<0.05），五者与DAS28均强相关，与ESR、CRP中度相关，与RF弱相关。

讨论部分总结，研究人员指出HIF1、VEGFA、E2F7、E2F8和IL-10为RA血管生成相关核心基因，HIF1信号通路显著表达；HIF1诱导下游VEGFA表达促血管生成，E2F7/8可与HIF1形成转录复合物刺激VEGFA活性，IL-10经JAK-STAT调控抑炎因子但在RA中抗炎效应被削弱；五者协同驱动RA滑膜复杂血管生成网络。核心基因通过与单核细胞、树突状细胞互作参与RA发病，HIF1增强抗原提呈，VEGFA促局部免疫应答，E2F7/8可能通过细胞周期调控参与病理血管生成与滑膜增生；共识聚类识别RA滑膜两血管生成相关分子亚型具不同免疫浸润模式。核心基因表达与RA临床活动度密切相关，HIF1、VEGFA、E2F8随严重度升高而上调，反映炎性滑膜微环境恶性循环，或可辅助评估滑膜炎症及进展风险。局限性在于临床验证用PBMCs而非滑膜组织、样本量较小且无功能实验验证机制。

结论部分翻译：RA中核心血管生成驱动因子集中于HIF1、VEGFA、E2F7、E2F8及IL-10，单核细胞与树突状细胞提供主要免疫输入，其中HIF1通路激活最显著。所有五个基因的表达均追踪临床疾病活动度；特别是HIF1、VEGFA与E2F8随严重程度升级同步上升。此种上调受炎性滑膜微环境塑造，表明这些基因通过在发炎滑膜内促进新生血管生成推动RA进展，从而将血管生成输出与疾病负担相耦合。