《Frontiers in Immunology》：Targeting Tumour Heterogeneity through sequential timing of anti-hallmark combination therapies -a hypothesis for implementation
自25年前癌症标志框架引入以来，治疗方法已演变为个性化医疗，为特定患者群体带来益处。然而，癌症中异型相互作用的三个主要组成部分——癌症干细胞的突变进化、上皮-间充质可塑性（epithelial-mesenchymal plasticity，EMP）以及癌症重塑的细胞外基质（extracellular matrix，ECM）——仍然是治疗的关键障碍，尤其是在治疗失败的患者中。EMP包括间充质和上皮状态之间的一系列来回转变，产生进化异质性的混合表型。这些嵌入在肿瘤微环境（tumor microenvironment，TME）的血管、代谢、突变和免疫抑制重编程中，由缺氧-活性氧（reactive oxygen species，ROS）-缺氧诱导因子-1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α）-转化生长因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）信号轴诱导和推进。本综述系统检验了EMP、肿瘤异质性和癌症标志的分子机制。它探讨了靶向肿瘤负荷、表观遗传学逆转过渡状态和恢复免疫编辑功能的药理学策略。基于此分析，研究人员提出了一种分阶段抗标志组合、时序和序贯（Combinations, Timing, and Sequencing，CTS）方案。该方法整合了血管正常化、表观遗传修饰剂、三模式放疗或立体定向体部放疗（stereotactic body radiotherapy，SBRT）、化疗（chemotherapy，CT）和免疫治疗优化，旨在改善结局的同时最小化毒性。此外，在机制上，通过逆转间充质表型和正常化血管，CTS方案旨在拯救免疫抑制性肿瘤微环境——减少髓源性抑制细胞（myeloid-derived suppressor cells，MDSCs）和调节性T（regulatory T，Treg）细胞的募集。这恢复了细胞毒性T细胞归巢，从而将免疫学“冷”肿瘤转化为“热”、免疫治疗应答性病变。
**2 Cancer initiation, progression, transition, stemness, and ecological evolution**
肿瘤起始、进展、转化、干性和生态进化部分阐述了肿瘤异质性和上皮-间充质可塑性（EMP）的驱动因素。首先，活性氧（ROS）-缺氧-缺氧诱导因子-1α（HIF-1α）-转化生长因子-β（TGF-β）信号轴通过多种应激机制（如氧化应激、代谢应激、免疫编辑应激、炎症应激、空间压缩应激和进化突变应激）促进肿瘤发生和进展。这些应激导致肿瘤微环境（TME）的重编程，包括血管异常、代谢重编程、免疫抑制以及癌症干细胞（CSC）特征的获得。上皮-间充质转化（EMT）和间充质-上皮转化（MET）的动态平衡构成EMP，使癌细胞适应不同微环境。癌细胞通过部分EMT状态维持迁移能力，同时保留部分上皮特征。缺氧诱导的乳酸酸中毒直接抑制细胞毒性T淋巴细胞（CTL）功能，促进免疫逃逸。TGF-β在早期起抑癌作用，但后期通过激活Snail和Smad通路促进EMT和纤维化。空间压缩和机械转导改变细胞外基质（ECM）硬度，促进侵袭。进化突变应激导致治疗耐药性，类似于“捕食者-猎物”动态。
**2.1 Primary drivers of tumor heterogeneity and EMP**
主要驱动因素包括：ROS-HIF-1α-TGF-β轴、代谢和线粒体应激（Warburg效应和乳酸酸化）、免疫编辑应激（免疫监视、平衡和逃逸）、炎症应激（TGF-β的双重作用）、空间压缩应激（机械转导）以及进化突变应激（基因组不稳定和治疗压力下的适应性进化）。
**2.1.1 ROS–hypoxia stress**
ROS积累导致HIF-1α稳定，进而影响代谢和线粒体功能，促进血管异常、代谢重编程、癌症干细胞特征和免疫失调，最终诱导EMT和侵袭。
**2.1.2 Metabolic and mitochondrial stress**
HIF-1α上调葡萄糖转运体（GLUTs）和乳酸脱氢酶A（LDHA），导致Warburg效应和乳酸堆积，酸化TME，抑制免疫细胞功能并促进耐药性。
**2.1.3 Immune editing stress and avoidance of immune destruction**
免疫编辑包括免疫监视、平衡和逃逸三个阶段。细胞毒性CD8
+ T细胞在初始阶段清除癌细胞，但随应激增加，癌细胞通过免疫编辑逃避免疫破坏，获得干细胞性和耐药性。
**2.1.4 Inflammatory stress and the role of TGF-β**
TGF-β在早期抑癌，后期通过“TGF-β开关”激活Snail和Smad通路，促进EMT、纤维化和免疫抑制。癌细胞、癌症相关成纤维细胞（CAFs）和肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）等维持EMT。
**2.1.5 Spatial and compression stress**
癌细胞增殖导致空间压缩，增加间质压力，形成物理屏障。机械转导将力学信号转化为生化信号，促进EMT和转移。
**2.1.6 Evolutionary mutational stress and the therapeutic “predator–prey” game**
治疗压力下，癌细胞通过基因组突变（如染色体重排、基因扩增）产生耐药性，类似于“捕食者-猎物”动态，小部分耐药细胞可重新增殖。
**2.2 Molecular drivers of EMT-MET heterogeneity**
EMT-MET异质性的分子驱动因素包括关键信号通路（如TGF-β、Wnt、Hedgehog）、转录因子（Snail、ZEB、TWIST）和microRNA（如miR-200c）。miR-200c与ZEB形成双负反馈回路，决定细胞处于上皮、间充质或混合状态。
**2.2.1 Key signaling pathways**
TGF-β激活Smad蛋白，调控EMT相关基因转录。其他通路如Wnt、Hedgehog和Notch也参与EMT调控。
**2.2.2 Transcription factors**
Snail家族（SNAI1、SNAI2）、ZEB家族（ZEB1、ZEB2）和TWIST1抑制E-cadherin表达，上调N-cadherin，促进间充质基因表达。
**2.2.3 Role of microRNA**
miR-200c通过ZEB/miR-200双负反馈回路调控EMT-MET转变，同时影响凋亡、炎症和免疫微环境。
**2.3 Mechanisms and impact of MET**
MET恢复细胞间连接和上皮标志物（如E-cadherin），降低迁移能力，增强治疗敏感性。骨形态发生蛋白7（BMP7）和降低TGF-β可促进MET。MET并非完全逆转，而是“逆转”过程，可能保留部分干细胞性。
**2.4 EMT-MET spectrum: epithelial-mesenchymal plasticity characterization**
EMP包含从完全上皮到完全间充质的连续谱系，包括部分EMT、不完全EMT、混合状态和可逆转变。EMP赋予癌细胞适应性和耐药性，是肿瘤侵袭和治疗抵抗的关键。
**3 Clinical implications of EMP**
EMP在治疗后出现预示预后不良。评估EMP和干细胞性可指导治疗策略。诱导MET可能促进MET驱动的增殖，因此需同时靶向MET和EMT细胞。诱导极端EMT逆转至终末分化（如脂肪细胞）是一种可行策略。
**4 Tumor heterogeneity, CSCS, and EMP—clonal cooperation**
肿瘤异质性包括空间、功能和机制层次。缺氧、酸性坏死核心富集静止癌细胞和CSC，而血管化边缘富集快速增殖细胞。CTS方案通过序贯处理不同区域：血管正常化、MET诱导、化疗/放疗、免疫治疗和维持治疗。
**5 Targeting tumor heterogeneity and the EMP maze**
靶向EMP可通过诱导MET使间充质样细胞恢复为上皮样，增强化疗敏感性。药物耐受性持续细胞（DTPs）是最难清除的，可通过表观遗传修饰剂诱导终末分化或凋亡。组蛋白去乙酰化酶抑制剂（HDACis）可重编程基因表达，促进上皮状态。
**5.1 Epigenetic modifiers**
表观遗传修饰剂通过逆转EMT、正常化血管和重塑ECM发挥作用。代表性药物包括艾日布林（eribulin）、HDAC抑制剂、MET抑制剂等。
**5.1.1 Eribulin—a clinical proof-of-concept for use of epigenetic modifiers**
艾日布林（eribulin）是一种微管动力学/染色质重塑抑制剂，可逆转EMT、正常化血管和重塑ECM。在临床试验中，它在初治三阴性乳腺癌中诱导MET，增强后续化疗敏感性，而传统紫杉类药物无此作用。
**5.1.2 Other epigenetic modifiers**
其他表观遗传修饰剂包括Snail-p53结合抑制剂、Co(III)-Ebox结合物、ML210、siDANCR纳米颗粒、二甲双胍、盐霉素、克唑替尼和miR-200模拟物，分别通过不同机制抑制EMT或诱导MET。
**5.1.3 Mechanism-based classification of epigenetic modifiers**
表观遗传修饰剂可分为五类：预防EMT和侵袭能力、通过MET转化增敏后续治疗、推动DTP/衰老细胞至易感状态、阻滞细胞周期以防止耐药进化、以及逆转至正常化或良性分化状态。
**5.2 Two concepts for one strategy**
传统最大耐受剂量（MTD）策略旨在快速清除癌细胞，而进化性治疗（EBT）考虑耐药亚群动态。CTS方案统一两者，通过MTD减瘤后，基于微小残留病（MRD）评估过渡到进化引导的维持治疗。
**6 Hypothesis—anti-hallmark combinations, timing, and sequencing strategy**
假说一：血管和TME正常化是癌症消除的可预测性必要条件。假说二：通过抗标志CTS策略可克服肿瘤异质性和EMP介导的耐药性，同时恢复免疫编辑。CTS方案包括五个阶段：血管正常化预启动（Phase Ia）、表观遗传修饰剂预启动（Phase Ib）、MTD减瘤治疗（Phase II）、免疫治疗优化（Phase III）、维持/巩固治疗（Phase IV-V）。
**6.1 The prerequisite—countering tumor neoangiogenesis and hypoxia**
血管正常化是有效药物递送和免疫治疗的前提。使用抗血管生成剂（AAGs）延长正常化窗口（如3周用药/3周停药）需通过生物标志物（如血浆VEGF）指导，但需注意反弹血管新生风险。
**6.2 Disabling invasion, replicative immortality, and cell death resistance: adapting the principle of “cancer cell therapy sensitization flow”**
通过序贯放置增敏药物（如TGF-β抑制剂、EMT-TF抑制剂）于早期，可增强后续化疗、放疗和免疫治疗的效果。放疗诱导的EMT可通过表观遗传修饰剂克服。吞噬检查点免疫治疗可增强T细胞反应。
**6.3 Managing sustained proliferative signaling and immune destruction avoidance**
癌细胞通过转分化（如神经内分泌表型）和DTPs逃避免疫破坏。BET蛋白抑制剂可诱导DTPs重新进入细胞周期时产生致死性ROS。表观遗传正向分化可终止恶性增殖信号。
**6.4 Prevention of genome instability, reduction of tumor-promoting inflammation, and restoring immune surveillance**
治疗不应留下“表观遗传损伤疤痕”。衰老细胞分泌衰老相关分泌表型（SASP），可能促进肿瘤进展。间断性衰老清除剂（senolytics）可防止SASP拯救DTPs。CTS方案通过增强免疫循环和记忆细胞池，重置免疫编辑。
**6.5 Drugs with multilevel broad-spectrum anti-hallmark action**
多水平作用药物（如艾日布林、TGF-β阻滞剂、缬沙坦）可同时作用于多个抗标志通路。血管紧张素受体阻滞剂通过抑制TGF-β降低间质压力，改善药物递送和免疫细胞浸润。
**6.6 Supporting literature evidence for the CTS strategy**
支持证据包括：CT联合EGFR-TKI（如FLAURA2试验）改善总生存期；血管正常化与SBRT联合优于血管破坏策略；SBRT剂量8-10 Gy/次可保留内皮完整性并激活cGAS-STING通路，增强免疫原性；循环SBRT可产生原位疫苗效应。
**6.7 Methodology of implementation of CTS strategy**
CTS方案的实施需系统进行五个阶段，以血管正常化为首步，随后依次进行表观遗传修饰、化疗/放疗、免疫治疗和维持治疗。
**6.8 Example of trial protocol flow: breast cancer**
以乳腺癌为例，Phase Ia使用贝伐珠单抗进行血管正常化；Phase Ib使用艾日布林诱导MET；Phase IIa进行标准辅助化疗（AC→紫杉醇）；Phase IIb加入靶向治疗（抗HER2等）；Phase III在PD-L1阳性三阴性乳腺癌中加用免疫治疗；Phase IV维持治疗（如PARP抑制剂）；Phase V通过生活方式、senolytics和细胞治疗预防复发。
**7 Limitations**
CTS方案可能无法实现所有患者根治，逆转后残留的DTPs、休眠细胞或衰老细胞可重新激活。需要系统性监测和理性治疗靶向（SMART）方法。
**8 Future research directions**
未来方向包括：临床将表观遗传修饰剂纳入EMP靶向策略；发展血浆VEGF和免疫肽组学监测；利用数学建模和单细胞测序；SBRT联合原位疫苗和纳米技术；推进EMT病理表征的标准化。
**9 Conclusions**
CTS方案通过整合血管正常化、表观遗传修饰、化疗/放疗和免疫治疗，将肿瘤异质性和EMP视为可靶向的脆弱性，而非障碍。序贯、非交叉耐药治疗可预防原发性耐药和进化性耐药。该策略融合了癌症标志、免疫编辑、血管正常化和进化治疗理论，有望通过风险分层减少毒性。
