苯并[a]芘对食管癌的毒理学影响：基于网络毒理学、机器学习和分子对接的综合分析

《Frontiers in Immunology》：Toxicological impact of benzo[a]pyrene on esophageal cancer: an integrated analysis via network toxicology, machine learning, and molecular docking

　　

背景：为了研究苯并[a]芘（benzo[a]pyrene, BaP）诱导食管癌（esophageal cancer, EC）的机制，并筛选和识别与BaP相关EC的关键靶点和生物标志物。方法：利用PharmMapper、SwissTargetPrediction和ChEMBL数据库预测BaP的潜在靶点，并与GEO数据库中的差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）进行交集分析，以筛选候选关键基因。随后，基于已识别的关键基因，使用14种机器学习算法构建诊断模型。同时，基于TCGA食管癌队列构建关键基因的预后模型，并进一步探讨这些关键基因与肿瘤免疫浸润的相关性。通过SHAP分析确定关键特征的贡献，提供了额外的可解释性。进行分子对接以验证BaP与核心靶点之间的结合。结果：共鉴定出82个基因作为BaP诱导的EC的潜在靶点。这些关键基因主要参与核心肿瘤相关通路、细胞周期调控、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase, MAPK）信号通路以及免疫炎症通路，涵盖了EC恶性转化的关键生物学过程。随后，通过机器学习分析确定了12个核心基因（ACOT9、ACOX3、AURKA、HMGCR、INHBA、MMP3、MSR1、SHC1、SORT1、MAOB、MMP13、CDK4）作为关键调控因子。其中，SORT1和ACOX3显著下调，而AURKA和MMP13显著上调（P < 0.05）。12基因预后模型能够实现食管癌患者的高效预后分层，且核心基因通过调节免疫细胞浸润参与食管癌免疫抑制微环境的重塑。分子对接显示BaP与靶蛋白之间具有较强的结合能力。结论：生物信息学分析和分子对接结果揭示了BaP与12个核心食管癌相关基因之间存在显著关联。BaP能够稳定结合AURKA、CDK4、MMP13和INHBA等核心蛋白，这可能与食管癌中细胞周期改变、代谢紊乱和肿瘤免疫微环境失调相关。通过机器学习鉴定的12个核心基因为环境毒理学与精准肿瘤学的跨学科领域提供了新视角，并为个体化治疗策略的开发奠定了基础。

**苯并[a]芘诱导食管癌的毒理学机制：整合网络毒理学、机器学习与分子模拟的系统分析**

**研究背景**
食管癌（esophageal cancer, EC）是全球高发的消化道恶性肿瘤，其发病率和死亡率居高不下，给公共卫生和患者带来沉重负担。食管鳞状细胞癌和腺癌是其主要病理类型，目前治疗受限于分子异质性和化疗耐药，预后仍不理想。因此，阐明环境风险因素及其潜在致癌分子机制，对于EC的早期筛查、风险防控及精准诊疗具有重要理论和临床意义。多环芳烃（polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs）暴露被认为是EC发生的重要危险因素之一。苯并[a]芘（benzo[a]pyrene, BaP）是PAHs中最具代表性的污染物，被国际癌症研究机构列为1类人类致癌物，其致癌性已被广泛证实。BaP来源广泛，主要产生于有机物质的不完全燃烧，包括烟草烟雾、烹饪油烟、工业排放、汽车尾气以及长期食用烧烤、熏制和油炸食品。BaP理化性质稳定、难降解，可通过吸入、饮食摄入和皮肤接触进入人体，长期蓄积后产生持续性毒性效应。已有研究证实BaP暴露与多种癌症风险显著相关，其致癌机制主要涉及DNA损伤与表观遗传改变、信号通路异常激活、炎症反应和氧化应激。然而，目前BaP诱导EC的研究存在明显不足，深入的系统性研究相对有限。网络毒理学的出现为分析毒理学效应提供了综合研究框架，它利用整合多组学分析系统构建化学物质、生物靶点和毒性通路之间的多维交互网络。本研究以BaP暴露与EC的关联为核心，整合网络毒理学、多组学分析、机器学习和分子模拟技术，系统探索BaP诱导EC的分子机制，旨在填补BaP诱导EC系统性机制研究的空白，探索潜在相关核心靶点和信号通路，为EC的早期风险预测、分层治疗及精准防控提供依据。

**主要关键技术方法**
本研究首先通过PharmMapper、SwissTargetPrediction和ChEMBL数据库预测BaP的潜在靶点（限制于人蛋白质组），并从NCBI的GEO数据库获取三个EC转录组数据集（GSE157804、GSE161533、GSE20347），利用代理变量分析和ComBat算法进行批次校正，通过差分表达分析（差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），阈值：错误发现率（false discovery rate, FDR）校正P < 0.05且|log2FC|>0.585）鉴定EC相关DEGs，取交集获得82个候选关键靶点。随后，基于这些靶点，在发现队列（校正后的GSE157804、GSE161533、GSE20347）中使用14种机器学习算法（包括弹性网络（Elastic Net）、套索（Lasso）、岭回归（Ridge）、支持向量机（support vector machine, SVM）、线性判别分析（linear discriminant analysis, LDA）、梯度提升机（gradient boosting machine, GBM）、随机森林（random forest, RF）、XGBoost等）构建116个预测模型，以三个独立数据集（GSE23400、GSE26886、GSE38129）作为外部验证队列，筛选最优模型并确定核心基因。进一步基于TCGA食管鳞状细胞癌（esophageal squamous cell carcinoma, ESCC）队列构建预后模型，利用多变量Cox比例风险回归计算风险评分，并通过Kaplan-Meier生存分析和时间依赖性受试者工作特征（receiver operating characteristic, ROC）曲线评估预后分层效能。免疫浸润分析采用CIBERSORT算法估算22种免疫细胞浸润丰度，与核心基因表达进行Spearman相关性分析。模型解释采用SHAP（SHapley Additive exPlanation）算法量化各特征的边际贡献。分子对接使用CB-Dock2平台评估BaP与核心靶蛋白的结合能力。此外，研究人员回顾性收集了5例有长期BaP暴露史（包括长期接触工业排放物、烟草烟雾或油炸食品）的EC手术患者（来自福州大学附属省立医院胸外科）的癌组织和癌旁正常组织石蜡切片，进行关键基因AURKA和MMP13的免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）检测，并补充未暴露对照。单细胞转录组分析采用GEO数据库中的GSE196756数据集，通过Seurat包进行质控、降维聚类和细胞类型注释。

**研究结果**

**3.1 鉴定BaP靶蛋白**
通过整合ChEMBL、SwissTargetPrediction和PharmMapper三个数据库，经去重后筛选出479个BaP候选靶点。

**3.2 鉴定EC相关靶基因**
整合三个数据集（GSE157804、GSE161533、GSE20347）并进行批次校正后，主成分分析（principal component analysis, PCA）显示样本分布趋于一致，批效应显著降低（ADONIS分析显示批标签解释的变异从79.8%降至3.0%）。差异表达分析鉴定出1729个在EC组织中显著改变的基因。将DEGs与BaP预测靶点取交集，获得82个潜在关键靶点。蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）网络显示这些基因存在广泛而紧密的互作关系。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析发现这些关键基因显著富集于细胞组分分解、激素代谢过程、纺锤体、中体、丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶复合物等生物学过程和细胞组分，以及丝氨酸型内肽酶活性等分子功能。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes, KEGG）通路富集分析显示关键基因最显著富集于癌症通路（Pathways in cancer），此外还富集于MAPK、过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator-activated receptor, PPAR）、细胞周期、Toll样受体（Toll-like receptor, TLR）信号通路以及p53、血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）、哺乳动物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin, mTOR）等促增殖通路和免疫相关通路。

**3.3 鉴定BaP诱导EC的核心基因**
通过系统机器学习分析82个候选靶点，构建116个预测模型，其中Lasso与RF组合模型在训练集和验证集均表现最佳。基于该最优模型，最终确定12个核心基因：ACOT9、ACOX3、AURKA、HMGCR、INHBA、MMP3、MSR1、SHC1、SORT1、MAOB、MMP13、CDK4。ROC曲线分析显示这些核心基因的曲线下面积（area under the curve, AUC）均大于0.85。基于这些基因构建的列线图（nomogram）模型具有良好的一致性（校准曲线）和临床净收益（决策曲线分析（decision curve analysis, DCA）），综合模型AUC达0.985（95% CI: 0.966-1.000）。

**3.4 基于核心基因的预后模型验证**
基于TCGA-ESCC队列构建的12基因预后模型中，Kaplan-Meier生存分析显示高风险组总生存期显著差于低风险组（HR = 5.396, 95% CI: 2.097-13.889, log-rank P = 0.000474）。ROC曲线分析显示1年和3年生存预测的AUC分别为0.747和0.857。

**3.5 核心基因的免疫浸润分析**
免疫细胞间相关性分析显示EC肿瘤微环境中存在复杂的免疫细胞互作网络。基因-免疫细胞相关性分析表明12个核心基因与多种免疫细胞浸润水平显著相关，如SHC1和MMP3与CD8⁺ T细胞浸润呈显著负相关，INHBA与M0巨噬细胞浸润呈强正相关，提示这些基因可能通过调节效应T细胞耗竭和肿瘤相关巨噬细胞富集参与免疫抑制微环境的形成。

**3.6 关键基因的SHAP分析**
SHAP分析表明AURKA（SHAP值=0.0425）和MMP13（0.0421）对模型预测贡献最大。IHC检测显示，在有潜在BaP暴露史的EC患者中，AURKA和MMP13在癌旁食管组织中呈高表达趋势。此外，HMGCR和ACOT9呈现表达水平依赖的双向调节模式，MMP13与MSR1之间存在协同增强正相关，ACOX3在高表达时保护效应最显著，而HMGCR和MSR1在中度表达时保护效应最强。

**3.7 单细胞转录组数据集验证**
单细胞转录组分析显示模型风险评分在不同细胞群中存在显著异质性：组织干细胞中评分中位数最高，髓系细胞群（包括共同髓系祖细胞（common myeloid progenitors, CMP）和单核细胞）也显示较高风险评分，而中性粒细胞和B细胞评分较低。单基因表达层面，AURKA在上皮细胞群中显著上调，MAOB在CMP中显著上调，INHBA在组织干细胞中高表达，MSR1在单核细胞中显著高表达。

**3.8 分子对接验证BaP与核心基因的相互作用**
分子对接分析显示BaP与10个靶蛋白（MAOB、AURKA、INHBA、MMP3、CDK4、MMP13、SORT1、SHC1、HMGCR、MSR1）均具有强结合亲和力，结合能均低于-5 kcal/mol，表明形成了稳定的分子间相互作用。

**讨论与结论**
本研究整合多组学数据集系统剖析了EC中与BaP暴露相关的分子特征。通过靶点预测筛选和多算法机器学习，鉴定出12个与BaP密切相关的核心基因，并验证了其在诊断模型中的强大区分能力，支持其作为BaP相关EC风险分层分子生物标志物的潜力。功能富集分析揭示这些基因主要富集于细胞周期调控、MAPK/mTOR、p53、VEGF及Toll样受体等经典致癌信号轴。单细胞转录组谱显示这些标志基因具有细胞类型特异性表达格局，特别是上皮细胞中AURKA的高表达与增殖异常相关，组织干细胞中INHBA的突出表达与干性维持相关，单核细胞中MSR1的富集与肿瘤相关炎症和免疫抑制表型相关。免疫相关性分析表明12个核心基因与EC中多种免疫细胞浸润丰度相关，提示其与免疫抑制肿瘤微环境存在潜在联系。分子对接从结构水平证实BaP与核心蛋白（如AURKA、CDK4、MMP13和INHBA）存在稳定结合，可能干扰细胞增殖、脂质代谢和蛋白水解信号。构建的12基因风险预测模型表现优异（AUC=0.985），列线图、校准曲线和决策曲线分析支持其良好的临床应用潜力。

研究结论部分翻译：
通过多组学整合和机器学习筛选，鉴定出12个与BaP相关食管恶性病变具有强分子关联的核心基因。结构分子对接证实了BaP与包括AURKA、MMP13和INHBA在内的关键蛋白之间存在稳定的分子间结合，这些标志基因与食管病变中失调的细胞周期信号、代谢稳态改变和干细胞转录程序相关。构建的12基因风险预测模型展现出良好的预测效能，可为环境相关食管癌的早期预警和风险评估提供依据，也为BaP相关致癌过程的靶向干预提供证据。