趋化因子受体依赖性炎症反应参与双打击诱导的实验性坏死性小肠结肠炎并代表潜在治疗靶点

《Frontiers in Immunology》：Chemokine-receptor-dependent inflammatory responses contribute to two-hit-induced experimental necrotizing enterocolitis and represent a potential therapeutic target

　　

背景：坏死性小肠结肠炎（Necrotizing enterocolitis, NEC）是一种早产婴儿远端小肠的严重多因素炎症性疾病，目前缺乏有效的预防和治疗策略。研究人员此前利用配方奶喂养（Formula feeding, FF）相关菌群失调联合后续病毒炎症的临床相关双打击策略，证明该过程通过产气克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）来源代谢物tilivalline（TV）和NK1.1+细胞依赖的机制诱导NEC。本研究探讨与炎症细胞招募相关的趋化因子受体依赖性炎症反应是否参与NEC发病，以及药物阻断趋化因子受体信号是否能减轻疾病进展。 方法：使用两种新型临床相关双打击模型在C57BL/6小鼠幼崽中诱导NEC：FF联合R837触发的病毒炎症，或母乳（Breastfeeding, BF）喂养幼崽TV灌胃后R837处理。部分实验中幼崽皮下预处理CCR2/CCR5/CXCR3信号药理抑制剂TAK-779。通过肠道通透性和组织学分析评估NEC样肠损伤；RT?qPCR和流式细胞术分别评估趋化因子受体表达和炎症细胞浸润；利用人NEC RNA?seq数据集（E?MTAB?15683）评估趋化因子受体基因表达。 结果：R837诱导的第二打击后，先前接受FF第一打击的小鼠幼崽表现出趋化因子及其受体的强烈诱导，伴随炎症细胞招募和NEC发生。TAK?779显著降低趋化因子及其受体表达，减轻炎症细胞招募，并在序贯FF和病毒炎症相关双打击过程中保护免受NEC。同样，BF幼崽接受TV第一打击后R837第二打击导致趋化因子及其受体表达升高并发生NEC，上述效应均被TAK?779预处理阻止。人NEC转录组数据分析显示病变肠组织中多种趋化因子及其受体表达增加。 结论：研究结果证明趋化因子受体依赖性炎症反应通过促进NK1.1+细胞及其他炎症细胞聚集参与NEC的进展。药理抑制趋化因子受体信号在再现疾病发病关键特征的临床相关实验双打击模型中减轻NEC，突出这些通路作为值得进一步研究的潜在治疗靶点。

研究背景方面，坏死性小肠结肠炎（Necrotizing enterocolitis, NEC）是影响早产儿不成熟远端小肠的一种破坏性炎症疾病，每年在美国影响高达11%的极低出生体重婴儿（<1500 g）。其特征是节段性黏膜坏死、微生物过度生长、肠壁积气和大量炎症细胞浸润，常导致败血症、多器官衰竭和死亡。尽管研究数十年，NEC仍无有效靶向治疗，主要因其潜在机制尚未完全明确。NEC被广泛认为是一种多因素疾病，源于多种易感因素汇聚，包括早产、配方奶喂养（Formula feeding, FF）、微生物菌群失调、缺氧缺血和异常免疫激活。NEC日益被认为是通过多打击过程发展，早期生活易感因素创造脆弱肠道环境，随后被继发性炎症或感染打击加剧。虽然细菌定植和异常免疫激活在NEC发病中受到广泛关注，但新证据表明具有胃肠嗜性的病毒感染可进一步加剧新生儿肠道黏膜炎症和组织损伤。Kaelin等人揭示细菌—病毒相互作用改变先于NEC突然发作。然而，生命早期喂养相关微生物因素如何作为初始致敏第一打击，并与随后病毒炎症第二打击相互作用以破坏发育中肠道稳态仍知之甚少。母乳喂养（Breastfeeding, BF）已知对NEC具有保护作用，而FF是疾病发作的主要风险因素。人乳促进有益共生微生物定植、支持免疫成熟并提供维持黏膜耐受的生物活性因子。相反，FF改变肠道微生物组成，有利于与BF婴儿显著不同的微生物群落定植，FF相关菌群失调与肠道炎症增加和NEC发生率升高相关。重要的是，单独FF通常不足以诱导NEC。临床研究显示NEC相关细菌如产气克雷伯菌（Klebsiella oxytoca）存在于新生儿鼻胃管喂养管生物膜中。因此，配方灌胃后这些细菌的优先定植被视为构成临床相关第一打击的易感因素，使新生儿肠道易于后续炎症第二打击下发生损伤。研究人员此前工作表明FF相关微生物信号作为一种易感因素，与随后病毒炎症相关第二打击一起通过自然杀伤（NK1.1⁺）细胞依赖机制驱动NEC发展。在此背景下，研究人员鉴定出在FF喂养新生儿中富集的产生tilivalline（TV，一种基因毒性吡咯苯二氮杂?代谢物）的产气克雷伯菌种复合体（Klebsiella oxytoca species complex, KoSC^TV+），且TV⁺KoSC常在NEC患者中检测到。这些til⁺克雷伯菌菌株合成tilimycin并转化为TV，其在小鼠胃肠道腔比值各异，TV是小肠主要代谢物。值得注意的是，TV作为第一打击，通过NK1.1⁺细胞依赖机制使肠道易于后续病毒炎症挑战下发生NEC，从而参与NEC发病。然而，双打击模型与炎症细胞招募和肠损伤之间的机制联系未知。为填补这一空白，研究人员假设趋化因子受体依赖性炎症反应是FF或TV序贯后续病毒炎症贡献NEC发展的机制纽带，并对此进行验证，最终发现趋化因子受体依赖性炎症反应是构成双打击过程促进NEC发展的重要下游炎症通路，靶向该事件可能是NEC预防的有前景策略。该研究发表在《Frontiers in Immunology》。

关键技术方法方面，研究人员使用两种临床相关双打击NEC实验模型，分别为配方奶喂养联合TLR7激动剂R837诱导病毒炎症，以及母乳喂养幼崽TV灌胃后R837处理，部分实验用TAK?779皮下预处理阻断CCR2/CCR5/CXCR3信号。通过肠道通透性检测（FITC?dextran FD?10）和H&E染色组织学评分评估肠损伤，RT?qPCR检测回肠趋化因子及受体（Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11、Ccr2、Ccr5、Cxcr2、Cxcr3）mRNA表达，流式细胞术分析回肠免疫细胞（NK1.1⁺细胞、NK1.1⁺CD3^?CD11b⁺、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、中性粒细胞、嗜酸性粒细胞、B细胞）浸润，并利用已发表人NEC肠组织RNA?seq数据集（E?MTAB?15683，7例手术确诊NEC与7例胎龄匹配先天性肠闭锁对照）进行差异表达分析以验证趋化因子受体在人NEC中的表达变化。

研究结果方面，3.1 A two?hit process involving formula feeding and viral inflammation increases the expression of chemokines and chemokine receptors during NEC development：研究人员比较基础条件下BF、人乳喂养（Human donor milk?feeding, HMF）和FF组幼崽回肠趋化因子及受体表达无差异，表明单独FF第一打击不足以触发显著炎症趋化因子反应；而R837第二打击后仅FF幼崽回肠Ccl2、Ccl3、Ccl4、Ccl5、Cxcl1、Cxcl2、Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11及受体Ccr2、Ccr5、Cxcr2、Cxcr3显著上调，并专属发生NEC样肠损伤，证实FF+R837双打击中趋化因子受体信号激活与NEC发展密切相关。

3.2 Pharmacological blockade of CCR2/CCR5/CXCR3 signaling attenuates viral inflammation?triggered NEC in FF neonatal mice：FF幼崽从P7?P10皮下预处理TAK?779（2.5 μg/g，b.i.d.）后P10给予R837 24小时，TAK?779单独处理不影响体重、存活率和肠通透性；R837处理FF幼崽体重下降、存活率降低、肠通透性增加并发生严重NEC样损伤，而TAK?779预处理幼崽全部存活，肠屏障完整，组织仅轻度绒毛水肿和浅表上皮脱落，表明药理阻断CCR2/CCR5/CXCR3信号对FF幼崽双打击诱导NEC具有强保护作用。

3.3 TAK?779 attenuates the effect of FF combined with viral inflammation on the induction of chemokine?receptor expression and inflammatory cell recruitment：TAK?779预处理不影响单纯FF组趋化因子受体表达；R837使FF幼崽上述基因显著上调，而TAK?779预处理显著下调所有检测趋化因子及Ccr2、Ccr5、Cxcr2、Cxcr3表达。流式显示R837使FF幼崽回肠NK1.1⁺细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞、嗜酸性粒细胞显著增加，中性粒细胞和B细胞无变化；TAK?779预处理显著减少NK1.1⁺细胞、单核细胞、巨噬细胞、CD4⁺T细胞、CD8⁺T细胞招募，树突状细胞仅轻微受影响，表明TAK?779通过抑制趋化因子受体依赖性炎症反应广泛减弱黏膜炎症细胞浸润。

3.4 Tilivalline?primed BF mouse pups display increased chemokine?receptor expression in the intestine and heightened susceptibility to NEC upon subsequent viral inflammation：BF幼崽P7?P10 TV灌胃（20 μg/次，b.i.d.）后P10 R837处理24小时发生NEC样损伤；单独R837使BF幼崽仅Ccl5、Ccr2、Ccr5上调；单独TV使BF幼崽Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11及Cxcr2、Cxcr3上调而不损伤肠组织；TV+R837协同显著增加Ccl2、Ccl4、Ccl5、Cxcl1、Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11及Ccr2、Ccr5、Cxcr2、Cxcr3表达，高于BF+R837和BF+TV组，表明TV作为微生物第一打击通过增强趋化因子受体驱动炎症反应提高对病毒炎症第二打击的NEC易感性。

3.5 TAK?779 prevents viral inflammation?induced NEC in TV?primed BF mouse pups：BF幼崽TV+P7?P10 TAK?779预处理+P10 R837处理后，TAK?779组体重显著增加、肠通透性降低，组织学绒毛结构保存、上皮损伤减轻，且回肠Ccl2、Ccl4、Ccl5、Cxcl1、Cxcl9、Cxcl10、Cxcl11（除Ccl3、Cxcl2外）及Ccr2、Ccr5、Cxcr2、Cxcr3显著低于Vehicle+TV+R837组，证明TAK?779在TV+R837双打击模型中也通过抑制趋化因子受体信号预防NEC。

3.6 Human NEC tissues exhibit increased expression of multiple chemokines and chemokine receptors in the gut：重新分析人NEC RNA?seq数据集显示，NEC肠组织较对照显著高表达CCL2、CCL3、CCL4、CXCL1、CXCL2、CXCL10、CXCL11及CCR2、CXCR2；CXCL9和CCR5有升高趋势但未达显著；CCL5和CXCR3无差异。尽管与人实验模型不完全重叠，但共享趋化因子受体特征支持趋化因子受体依赖性炎症在人NEC中的临床相关性。

讨论部分总结方面，研究人员指出本研究首次揭示趋化因子受体依赖性炎症反应在细菌与病毒序贯扰动诱导NEC中的作用，FF及其关联微生物代谢物TV作为致敏第一打击使新生儿肠道对病毒炎症第二打击敏感，伴随Ccl2/3/4/5、Cxcl1/2/9/10/11及其受体Ccr2/Ccr5/Cxcr2/Cxcr3激活及NK1.1⁺等炎症细胞招募，人NEC组织也呈现部分相同特征。TAK?779通过阻断CCR2/CCR5/CXCR3信号减轻炎症细胞招募并保护双打击模型NEC，提示该通路为潜在治疗靶点。研究同时存在局限：TAK?779抑制多受体无法区分单个贡献；RT?qPCR未做多重检验校正；缺乏受体特异性遗传学手段；未完全排除窝效应和性别影响；组织学取最重片段可能高估峰值损伤；模型为病毒炎症相关NEC样未必代表其他类型；人数据集样本量小且仅代表晚期病变。尽管如此，两种双打击模型与人数据一致支持趋化因子受体信号在NEC进展中的作用，为未来受体特异性研究奠定基础。

研究结论部分翻译方面：总之，研究表明趋化因子受体依赖性炎症反应有助于NEC发展的传播。使用两种临床相关双打击实验性NEC模型，研究人员证明FF或微生物代谢物TV作为致敏第一打击因素，在病毒炎症来源第二打击下增加肠道对NEC的易感性。进一步证明此双打击病理生理过程伴随趋化因子受体依赖性炎症反应激活和NEC样肠损伤发生。趋化因子及其受体表达增加与炎症细胞招募（包括NK1.1⁺细胞聚集）和NEC发展相吻合。药理抑制CCR2/CCR5/CXCR3信号减少炎症反应并减轻两种实验模型中疾病严重程度。总之，这些结果支持趋化因子受体信号是通过序贯致病打击促进NEC发病的重要炎症通路这一观点。尽管单个趋化因子受体和免疫细胞亚群的特定贡献需进一步研究，但这些结果表明趋化因子受体依赖性炎症通路在双打击诱导NEC发展中起重要作用，值得在实验和临床研究中作为潜在治疗靶点进一步探讨。