《British Journal of Cancer》：Reactivation of DRP1 plays a functional role in resistance to MEK inhibition in pancreatic cancer cells
编辑推荐：
在RAS突变肿瘤中，ERK磷酸化线粒体分裂GTP酶DRP1以促进线粒体分裂。DRP1活性在胰腺癌及其他RAS驱动癌症中具有促肿瘤作用，但其在治疗抵抗中的角色尚不清楚。研究人员构建了针对MEK抑制剂trametinib耐药的患者来源胰腺癌细胞系面板，通过免疫荧光
在RAS突变肿瘤中，ERK磷酸化线粒体分裂GTP酶DRP1以促进线粒体分裂。DRP1活性在胰腺癌及其他RAS驱动癌症中具有促肿瘤作用，但其在治疗抵抗中的角色尚不清楚。研究人员构建了针对MEK抑制剂trametinib耐药的患者来源胰腺癌细胞系面板，通过免疫荧光成像、体外生长测定及原位异种移植确定DRP1在trametinib抵抗中的作用。研究发现，与敏感对应细胞相比，trametinib耐药细胞表现出DRP1表达及磷酸化增加；线粒体结构的定量分析显示，耐药细胞中的线粒体在形态上显著不同且相对小于经trametinib处理的敏感细胞；遗传及药理学抑制c-Myc与CDK6均足以阻断耐药细胞中DRP1的磷酸化，表明在缺乏MAPK信号时，c-Myc-CDK6信号轴的激活驱动了线粒体分裂的再激活；重要的是，删除DRP1可导致耐药细胞系的生长抑制或对trametinib的再增敏。这些发现提示DRP1参与药物抵抗，抑制线粒体分裂可能是对抗MAPK及RAS抑制剂抵抗的有前景的治疗策略。
研究背景方面，胰腺导管腺癌（PDAC）患者5年生存率仅13%，超过90%的PDAC肿瘤存在KRAS激活突变，驱动下游效应通路促进肿瘤表型。尽管开发了靶向KRAS效应通路如RAF-MEK-ERK MAPK通路及直接靶向KRAS的抑制剂，但PDAC中靶向治疗大多未成功，如MEK抑制剂trametinib未能改善PDAC患者生存，提示PDAC中对RAS-MAPK抑制迅速产生抵抗，亟需理解抵抗机制以开发新策略。线粒体动态由DRP1（调节线粒体分裂）、MFN1/2与OPA1（分别调节线粒体外膜与内膜融合）的相对活性决定，致癌RAS下游信号通过ERK介导的DRP1丝氨酸616（S616）磷酸化导致线粒体片段化表型，阻断DRP1磷酸化可使线粒体转向更互联表型，遗传抑制DRP1可降低KRAS驱动胰腺癌模型的肿瘤负荷并提高生存，但DRP1与线粒体分裂在RAS-MAPK信号靶向治疗抵抗中的作用未知。
研究人员开展的研究为建立trametinib耐药的患者来源胰腺癌细胞系面板（包括188、395、PANC-1、CFPAC-1），通过免疫荧光成像、体外生长测定、原位异种移植及Western blot、线粒体形态分析、PCA、细胞活力测定、质粒生成与细胞转染、体外激酶测定等技术，探究DRP1介导的线粒体分裂在PDAC细胞获得性trametinib抵抗中的作用及机制。
主要关键技术方法包括：构建trametinib耐药的患者来源胰腺癌细胞系面板（来源为188、395患者来源异种移植细胞系及PANC-1、CFPAC-1既定患者来源细胞系）；采用免疫荧光成像与MitoHacker进行线粒体形态定量分析；通过Western blot检测蛋白表达与磷酸化水平；利用原代成分分析（PCA）解析线粒体结构特征差异；开展CellTiterGlo（CTG）细胞活力测定评估生长；进行质粒生成、细胞转染建立基因操纵细胞系；实施体外激酶测定验证激酶直接磷酸化作用；通过原位异种移植在裸鼠体内评估体内肿瘤生长与DRP1功能。
研究结果部分：
Trametinib resistant pancreatic cancer cells exhibit increased DRP1 S616 phosphorylation
研究人员通过建立trametinib耐药细胞系（188R、395R、PANC-1R、CFPAC-1R）并检测IC50，发现耐药细胞IC50显著高于敏感细胞；Western blot显示敏感细胞经trametinib处理后DRP1 S616磷酸化降低，而耐药细胞经trametinib处理后DRP1 S616磷酸化显著增加，部分耐药细胞总DRP1水平升高；线粒体融合介质MFN1、MFN1、OPA1表达无显著变化；trametinib处理显著降低所有耐药细胞P-ERK与P-ELK1水平，表明DRP1磷酸化维持源于替代激酶而非MAPK再激活。
Trametinib-resistant pancreatic cancer cells exhibit distinct mitochondrial morphology compared to sensitive cells
研究人员通过共聚焦显微镜结合MitoHacker分析发现，敏感细胞经trametinib处理后线粒体更互联分布于胞质，而耐药细胞无论DMSO或trametinib处理下线粒体形态均与敏感细胞显著不同；PCA分析显示，trametinib处理后敏感与耐药细胞沿PC1、PC2分离，耐药细胞线粒体长度、面积、密度相关特征未如敏感细胞上调，分布相关特征（extent、roundness）未下调，表明耐药导致DRP1活性改变并引起线粒体网络结构可测量变化。
c-Myc contributes to DRP1 S616 phosphorylation in trametinib resistant cells
研究人员观察到耐药细胞c-Myc水平升高；用c-Myc抑制剂10058-F4或诱导shRNA敲低c-Myc后，耐药细胞DRP1 S616磷酸化显著降低，且对ERK磷酸化影响极小，表明c-Myc贡献于耐药细胞DRP1 S616磷酸化，此贡献在敏感细胞中已存在。
CDK6 contributes to DRP1 S616 phosphorylation in trametinib resistant pancreatic cancer cells
研究人员发现c-Myc抑制降低CDK4/6底物RB S807/811磷酸化；用CDK4/6抑制剂abemaciclib处理耐药细胞可抑制DRP1 S616磷酸化及RB磷酸化，且不恢复ERK磷酸化；shRNA敲低CDK6比CDK4更显著降低DRP1 S616磷酸化；体外激酶测定显示重组CyclinD1/CDK6复合物可直接磷酸化重组DRP1 C端（aa518-736）的S616，S616A突变体无磷酸化；敲低CDK2不影响DRP1 S616磷酸化，表明CDK6直接磷酸化DRP1维持耐药细胞其磷酸化。
Inhibition of DRP1 or CDK4/6 is able to resensitize or inhibit growth of the trametinib resistant cells
研究人员诱导DRP1敲除（DRP1KO）发现，395R、PANC-1R、CFPAC-1R生长停滞，188R对DRP1KO单独不敏感但对trametinib部分再增敏；abemaciclib抑制所有测试耐药细胞生长，且在有无trametinib时均抑制188R、395R、PANC-1R生长；体内原位异种移植显示，耐药细胞在小鼠体内维持抵抗与DRP1 S616磷酸化升高，DRP1敲除小鼠经trametinib处理后肿瘤负荷显著低于sgCTR细胞小鼠，表明DRP1在体内抵抗表型中具有功能重要性。
讨论部分总结：DRP1介导的线粒体分裂是RAS-MAPK驱动恶性肿瘤生长的关键过程，本研究显示持续DRP1磷酸化是trametinib耐药PDAC细胞特征且耐药细胞对DRP1抑制敏感，c-Myc-CDK4/6信号轴激活维持DRP1激活，提示靶向线粒体分裂是对抗RAS-MAPK抑制抵抗的可行策略；DRP1促进耐药细胞存活增殖的机制可能涉及RAS诱导糖酵解转换及线粒体自噬（mitophagy）；耐药细胞线粒体结构异质，除DRP1磷酸化外另有遗传与环境因子贡献；靶向DRP1可再增敏或抑制耐药细胞生长，区分仅需DRP1抑制或需联合MEK抑制的因素待究；DRP1 S616磷酸化依赖CDK4/6，CDK6更直接，CDKN2A（编码p16）在PDAC频发突变提示CDK4/6可能预存激活DRP1；c-Myc与CDK6可能存在互调；体内证实DRP1功能重要性及耐药细胞对trametinib的“成瘾”现象；结论为c-Myc-CDK6-DRP1信号轴在MEK抑制剂耐药胰腺癌细胞中起作用，凸显线粒体动态在胰腺肿瘤生长的重要性并为干预提供新途径。
研究结论部分翻译：DRP1介导的线粒体分裂已被证明是促成多种RAS-MAPK驱动恶性肿瘤生长的关键生物学过程。与此一致，我们现证明持续的DRP1磷酸化是开发出RAS-MAPK靶向治疗的胰腺癌细胞的特征，且耐药PDAC细胞对DRP1抑制敏感。此外，我们显示c-Myc-CDK4/6信号轴被激活以维持这些细胞中DRP1的激活。综上，本工作提示靶向线粒体分裂可能是对抗胰腺癌及其他RAS驱动恶性肿瘤中RAS-MAPK抑制抵抗的具吸引力的选项。
