免疫治疗黑色素瘤患者中淋巴细胞和免疫通路的肿瘤景观

《Genes & Immunity》：The tumoural landscape of lymphocytes and immune pathways in immunotherapy-treated melanoma patients

　　

肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)塑造黑色素瘤的行为和对免疫治疗的反应，但免疫调节、TIL模式和预后之间的联系仍不清楚。研究人员回顾性研究了32例接受抗PD-1(anti–PD-1)治疗患者的原发性黑色素瘤样本。组织病理学TILs被分类为活跃(brisk)或非活跃(non-brisk)模式，并对原发肿瘤进行了靶向免疫转录组学分析(NanoString nCounter Human Immunology panel)。外部验证使用了96例TCGA-SKCM原发肿瘤。活跃(brisk)肿瘤显示出免疫转录本的广泛上调，并富集了粘附通路(directed global significance scores – DGSS=2.15)和MHC II类抗原呈递(DGSS=2.128)。跨队列比较确定了22个共享的差异表达基因，其中ZAP70在两个数据集中均保持显著。活跃(brisk)肿瘤还显示出更高的总TIL(total TIL, p=0.036)、细胞毒性细胞(cytotoxic-cell, p=0.0095)和Th1(Th1, p=0.027)评分。与反应相关的基因因TIL模式而异，亚组特异性基因评分可预测活跃(brisk)肿瘤(4基因，曲线下面积Area under curve - AUC=1.000)和非活跃(non-brisk)肿瘤(3基因，AUC=0.852)中的抗PD-1(anti–PD-1)获益；非活跃(non-brisk)评分仍与反应独立相关(p=0.029)。较高的评分也与更长的生存期相关。整合组织病理学TIL模式与免疫转录组学可改进预后判断并为黑色素瘤免疫治疗分层提供支持。

**黑色素瘤免疫治疗中淋巴细胞与免疫通路的肿瘤景观：一项整合组织病理学与转录组学的研究解读**

**研究背景与问题**

黑色素瘤是一种起源于黑素细胞的侵袭性恶性肿瘤，即使微小病灶也具备转移潜能。其重要预后因素包括Breslow厚度、组织学溃疡和有丝分裂率。肿瘤微环境在黑色素瘤的发生、进展和治疗反应中起核心作用，其中免疫浸润的评估尤为重要。肿瘤浸润淋巴细胞(Tumor-infiltrating lymphocytes, TILs)由Clark等人在1989年引入，组织病理学上根据淋巴细胞的密度模式分为活跃(brisk)、非活跃(non-brisk)或缺失(absent)三类。当前，TIL模式在生存预后和免疫检查点抑制剂治疗反应预测中的价值已被广泛研究，但免疫通路调节、TIL浸润与临床结果之间的具体联系尚未完全阐明。因此，本研究旨在评估免疫相关基因表达谱、TIL模式与接受抗PD-1免疫治疗的黑色素瘤患者临床结局之间的关联。

**研究内容与主要结论**

研究人员开展了一项回顾性观察性研究，纳入32例来自巴西巴雷托斯癌症医院(Barretos Cancer Hospital)的原发性黑色素瘤患者，所有患者均接受抗PD-1单药治疗（纳武利尤单抗或帕博利珠单抗）。通过组织病理学评估将TILs分为活跃(brisk)或非活跃(non-brisk)模式，并利用NanoString nCounter Human Immunology panel进行靶向免疫转录组学分析。外部验证采用癌症基因组图谱(The Cancer Genome Atlas, TCGA)中96例原发性皮肤黑色素瘤(TCGA-SKCM)队列。主要结论：活跃(brisk)肿瘤显示出广泛的免疫转录本上调，富集细胞粘附和MHC II类抗原呈递通路，ZAP70在两组数据中均保持显著差异。基于反应相关基因分别构建的亚组特异性基因评分可准确预测抗PD-1治疗获益（活跃组4基因评分AUC=1.000，非活跃组3基因评分AUC=0.852），其中非活跃评分与反应独立相关(p=0.029)。较高评分亦与更长的总生存期(OS)、无进展生存期(PFS)和免疫治疗后生存期(PIS)相关。该研究的意义在于：整合组织病理学TIL模式与免疫转录组学可改进预后判断，并为黑色素瘤免疫治疗分层提供支持。论文发表在《Genes》。

**主要关键技术方法**

本研究采用回顾性队列设计，样本来源于巴西巴雷托斯癌症医院的32例原发性黑色素瘤FFPE标本。组织病理学评估由两位病理学家独立完成，基于H&E染色切片将TILs分为活跃(brisk)或非活跃(non-brisk)。基因表达谱使用NanoString nCounter Human Immunology v2 Panel（594个免疫相关基因和15个内参基因，RNA输入250 ng），差异表达分析采用nSolver Advanced Analysis模块的适应性模型选择策略，调整Clark水平和Breslow厚度。通路分析使用Gene Set Analysis (GSA)和Pathway Scoring模块计算定向全局显著性评分(DGSS)。免疫细胞丰度通过Cell Type Profiling模块基于细胞类型特异性标记基因推断。临床结果分析中，使用弹性网络惩罚逻辑回归（α=0.5，1000次bootstrap重采样）构建基因评分，通过ROC曲线评估预测性能。外部验证使用TCGA-SKCM队列96例原发肿瘤，数字H&E切片由相同评估者分类，差异表达分析使用edgeR。

**研究结果**

**Most immune-related genes and pathways were overexpressed in TILs brisk:** 基于组织病理学TIL评估，32例患者中11例为活跃(brisk)，21例为非活跃(non-brisk)。活跃组多数为Clark IV级(81.8%)且Breslow厚度较低(4.2 mm)，非活跃组多数为Clark V级(65.0%)且Breslow厚度较高(8.0 mm)（均p<0.01）。594个基因中，68个在TIL模式间差异表达，活跃组64个上调，非活跃组4个上调。经Benjamini-Hochberg(BH)校正后，HLA-C、SELL、TLR1和ZAP70仍显著上调于活跃组。

**TCGA validation confirmed part of the brisk-associated transcriptional profile:** 在TCGA-SKCM的96例原发肿瘤（51例活跃，45例非活跃）中，鉴定出80个基因在活跃组上调、30个在非活跃组上调。22个基因在两个队列中均差异表达，但CXCL1方向不一致。经多重检验校正后，仅ZAP70在两个队列的活跃组均显著上调(p<0.05)。

**Immune-related pathways were enriched in brisk TIL tumors:** GSA分析显示活跃组中多个通路高DGSS，尤其是细胞粘附(DGSS=2.15)和MHC II类抗原呈递(DGSS=2.128)。样本水平通路分析显示，T细胞受体信号、MHC I类抗原呈递、趋化因子信号、适应性免疫系统、II型干扰素信号和淋巴细胞激活在活跃组显著（名义p<0.05），但多重校正后无显著性。

**Non-brisk tumors showed relatively higher proportions of exhausted T cells, macrophages, and NK cells:** 细胞类型评分显示活跃组B细胞、CD45⁺细胞、细胞毒性细胞、中性粒细胞、T细胞和Treg细胞水平显著更高（BH校正p<0.05）；Th1细胞和CD8⁺T细胞评分也较高（名义p<0.05，校正后p=0.052）。免疫细胞比例分析表明，活跃组总TIL和CD8⁺T细胞/耗竭CD8⁺T细胞比例更高，而非活跃组耗竭CD8⁺T细胞/TIL、巨噬细胞/TIL、NK CD56^dim/TIL和NK细胞/TIL比例更高（均BH校正p<0.05）。

**Predictive genes of immunotherapy response differ between TILs brisk and non-brisk patients:** 在活跃和非活跃组内分别进行免疫治疗反应相关的差异表达分析，发现大多数上调基因出现于无应答者，且两组基因不同。C5、CFI和ZEB1在两组无应答者中均上调；SPP1在活跃组应答者中上调，但在非活跃组无应答者中上调。活跃组中SPP1与淋巴细胞运输、吞噬降解、趋化因子信号、TNF家族信号和细胞毒性细胞呈负相关；非活跃组中SPP1与淋巴细胞运输、吞噬降解及巨噬细胞绝对和相对比例呈正相关，与细胞毒性细胞、Treg细胞和T细胞的相对比例呈负相关。

**Upregulated pathways associated with immunotherapy response were different in TILs brisk and non-brisk:** 通路分析显示，活跃组无应答者中补体系统(DGSS=1.463)、Th1分化(DGSS=1.442)和Th2分化(DGSS=1.407)较高；非活跃组无应答者中细胞粘附通路最高(DGSS=0.859)。样本水平通路分析及细胞类型丰度与比例在两组内部均无显著差异。

**Distinct genes were associated with survival endpoints in TILs brisk and TILS non-brisk cohorts:** 在活跃组，8个基因与OS相关，1个与PFS相关，7个与PIS相关；在非活跃组，4个基因与OS相关，6个与PFS相关，5个与PIS相关。评分成分中仅MAPKAPK2与OS(HR 2.92, 95%CI 1.08–7.90, p=0.035)和PIS(HR 2.41, 95%CI 1.00–5.78, p=0.049)显著相关。活跃组4基因评分与OS(p=0.024)和PIS(p=0.033)显著相关；非活跃组3基因评分与PFS(p=0.037)和PIS(p=0.034)显著相关。TCGA队列中两评分均显示与OS改善的趋势但未达统计学显著性。

**讨论总结与研究结论翻译**

本研究证实，TIL活跃(brisk)形态与更广泛的免疫相关转录程序一致，但活跃和非活跃肿瘤内部均存在与预后相关的异质性。活跃肿瘤富集抗原呈递、T细胞受体、趋化因子、干扰素-γ和淋巴细胞激活通路，并具有更高的淋巴和细胞毒性细胞评分；非活跃肿瘤则呈现更高的耗竭CD8⁺T细胞/TIL、巨噬细胞/TIL和NK细胞/TIL比例，提示其微环境功能低效而非单纯免疫细胞数量缺乏。基因表达评分能有效捕捉抗肿瘤免疫与调节性炎症程序的复杂相互作用，尤其非活跃肿瘤的评分在调整临床病理变量后仍是免疫治疗反应的独立预测因子。生存分析进一步支持了这些特征在预测二元反应之外的临床相关性。研究结论（翻译）：总体而言，本研究数据支持以下概念：TIL活跃(brisk)形态与更广泛的免疫相关转录程序一致，而在活跃和非活跃肿瘤内部均存在与预后相关的异质性。整合组织病理学TIL模式与免疫转录组学可改进黑色素瘤患者的预后判断，并为免疫治疗分层提供支持。然而，这些结果应被视为探索性和假设产生性的，主要限制包括：小样本量导致的统计效力不足，bulk基因表达分析无法区分细胞类型特异性或肿瘤内在贡献及空间组织，以及原发肿瘤与转移灶之间免疫微环境的时空异质性。因此，需要在更大规模、更均质化的队列中采用更高分辨率方法（如空间或单细胞分析）进行验证。