《Leukemia》：DNA methylation signatures distinguish extranodal NK/T-cell lymphoma and EBV-positive nodal T/NK-cell lymphoma and identify prognostic subgroups
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结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）和原发性EB病毒（EBV）阳性结性T/NK细胞淋巴瘤（nodal-TNKL）是具有重叠临床病理特征但潜在生物学基础不同的侵袭性淋巴瘤。尽管其基因组图谱已日益明确，但比较性表观遗传学特征仍有限。研究人员对ENKTL、nodal
结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）和原发性EB病毒（EBV）阳性结性T/NK细胞淋巴瘤（nodal-TNKL）是具有重叠临床病理特征但潜在生物学基础不同的侵袭性淋巴瘤。尽管其基因组图谱已日益明确，但比较性表观遗传学特征仍有限。研究人员对ENKTL、nodal-TNKL、ENKTL细胞系和对照组织的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行了甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）。ENKTL显示出广泛的启动子高甲基化，与肿瘤抑制基因、谱系调节因子和淋巴样信号基因（包括LEF1和BANK1）的抑制相关，同时伴有免疫和干扰素应答基因（如IFITM1）的局灶性低甲基化。相比之下，nodal-TNKL显示出全局性低甲基化，特别影响细胞毒性、免疫应答和抗原呈递通路；TET2突变的nodal-TNKL病例表现出基因座特异性的甲基化变化。在所有样本中，全局DNA甲基化水平与基因组不稳定性（GI）相关。无监督聚类识别出两个表观遗传学上不同的ENKTL亚组，其中一个亚组以更高的全局甲基化、TP53缺失、拷贝数改变（CNA）和杂合性缺失（LOH）增加以及显著更差的总生存期（OS）为特征。总之，这项研究定义了ENKTL和nodal-TNKL之间的基本表观遗传学差异，并将DNA甲基化动态与基因组不稳定性和临床结局联系起来，突显了甲基化分析在精细分类、风险分层和治疗指导中的价值。
**研究背景**
结外NK/T细胞淋巴瘤（ENKTL）和原发性EB病毒（EBV）阳性结性T/NK细胞淋巴瘤（nodal-TNKL）是两种侵袭性EBV相关淋巴瘤。尽管它们在临床病理特征上存在重叠，但其分子生物学基础不同。已有研究揭示了nodal-TNKL独特的分子景观，包括免疫通路激活和表观遗传调控基因（如TET2和DNMT3A）的频繁突变。与ENKTL相比，nodal-TNKL还表现出较低的基因组不稳定性（GI），但这是否反映了癌症进展过程中DNA损伤应答的破坏尚不明确。尽管取得了这些进展，ENKTL和nodal-TNKL的表观遗传学机制仍定义不清，且缺乏比较性DNA甲基化分析。DNA甲基化是基因表达的核心调控者，在癌症中，其失调不仅限于肿瘤抑制基因（TSG）的沉默，还涉及与可塑性、免疫逃逸和治疗耐药相关的谱系身份和发育程序的重编程。已有证据支持DNA甲基化在ENKTL发病机制中的重要作用，包括表观遗传修饰基因（如TET2和KMT2D）的突变，以及CpG岛甲基化样表型的广泛启动子高甲基化和TSG（如PRDM1、BIM和SHP1）的沉默。然而，nodal-TNKL的表观遗传学景观在很大程度上仍未被探索，系统性DNA甲基化分析尚属空白。鉴于nodal-TNKL中超过60%的病例存在TET2和/或DNMT3A突变，并与潜能未定的克隆性造血（CHIP）相关，比较分析ENKTL和nodal-TNKL的甲基化模式对于定义这些EBV相关淋巴瘤中共享和疾病特异性的表观遗传程序，以及阐明CHIP相关突变如何塑造其表观遗传程序至关重要。
**主要技术方法**
研究人员对ENKTL患者（n=43，来自39名患者）、nodal-TNKL患者（n=12）以及ENKTL衍生细胞系（n=5）的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本进行了甲基化DNA免疫沉淀测序（MeDIP-seq）。对照样本包括来自反应性扁桃体、淋巴结、鼻黏膜以及纯化原代T细胞和NK细胞的FFPE组织。主要关键技术包括：使用抗5-甲基胞嘧啶单克隆抗体进行甲基化DNA免疫沉淀，随后进行文库制备和Illumina HiSeq平台测序；使用QSEA软件进行全基因组甲基化区域鉴定和组间差异分析；通过ChIPseeker进行差异甲基化区域（DMR）注释；使用HOMER进行转录因子结合基序富集分析；将启动子甲基化值与来自Clariom D微阵列的基因表达数据进行相关性分析；使用decemedip和CIBERSORTx进行细胞类型反卷积；使用OncoScan? FFPE芯片分析拷贝数（CN）图谱，并计算杂合性缺失（LOH）、基因组不稳定性（GI）和同源重组缺陷（HRD）评分。
**研究结果**
**MeDIP-Seq揭示ENKTL和nodal-TNKL之间的全局甲基化差异**
通过对ENKTL、nodal-TNKL、ENKTL细胞系和对照FFPE样本进行MeDIP-Seq，研究人员识别出9232个DMR，对应5068个差异甲基化基因（DMG）。主成分分析（PCA）和层次聚类均显示ENKTL和nodal-TNKL之间存在明显分离，反映了潜在的生物学差异。与对照组相比，ENKTL样本表现出广泛的超甲基化，而nodal-TNKL样本则表现出广泛的低甲基化，支持了它们之间的表观遗传学区别。
**ENKTL的特征是影响关键基因和调控通路的广泛超甲基化**
通过比较ENKTL样本与所有对照，识别出7301个DMR（对应4195个DMG）。无监督层次聚类将ENKTL分为两个基于甲基化的亚组（ENKTL-组1和ENKTL-组2）。在超甲基化区域中，研究人员确认了先前报道的基因（如ASNS、CHST15、PTPN6、SOCS6、TET2和PRDM1），并识别出新的超甲基化靶点，包括表观遗传调控因子（DNMT3A、DNMT3B、KDM5B）、T/NK谱系转录因子（如LEF1、TCF7、BCL11B）、JAK/STAT和WNT/NOTCH信号成分以及受体酪氨酸激酶（EGFR、KIT、MET、NTRK1）。通路富集分析显示PI3K-AKT、MAPK、RAP1、Hippo和WNT等致癌信号通路过度代表性。通过HOMER进行的基序富集分析显示，超甲基化DMR在发育和谱系相关转录因子（如Pitx1、Hmx3）以及免疫或应激相关调控因子（如HIF1A）的基序中富集。将甲基化数据与基因表达谱整合分析，识别出81个具有反向甲基化-表达关联的基因，涉及凋亡、DNA损伤和细胞周期调控、表观遗传调控、JAK/STAT、Wnt/β-catenin、RAS-MAPK/PI3K信号通路、转录调控和免疫应答。其中，BANK1、BACH2和LEF1/LEF1-AS1表现出启动子超甲基化和表达降低，而BCL7B、IFITM1和CKS2则表现出启动子低甲基化和表达升高。单细胞RNA测序数据（GSE203663）进一步验证了肿瘤细胞中BACH2、LEF1和BANK1的低表达，以及IFITM1和CKS2的高表达。
**ENKTL分为两个表观遗传学上不同的亚组，具有不同的临床结局**
ENKTL-组2样本表现出更高的整体甲基化水平，尤其是在启动子、5'UTR、外显子和内含子区域，并具有显著更差的总生存期（OS）。差异甲基化分析识别出27个显著DMR（对应27个基因），其中26个在ENKTL-组2中超甲基化，富集于发育和分化通路。值得注意的是，ENKTL-组2表现出更高的总拷贝数改变（CNA）负担和杂合性缺失（LOH）水平。最显著的局灶性改变是17p13.1缺失（包含TP53），在ENKTL-组2病例中更频繁。这些数据将ENKTL-组2定义为一种与增加CNA、频繁TP53缺失、更高LOH负担和较差OS相关的超甲基化表观遗传亚型。
**nodal-TNKL中的广泛低甲基化是免疫激活通路富集的基础**
通过比较nodal-TNKL与对照，识别出2882个DMR（对应655个DMG），其中绝大多数（2879/2882）表现出显著低甲基化。基因本体分析显示低甲基化基因在免疫激活通路中显著富集，包括白细胞介导的细胞毒性、抗原处理和呈递以及T细胞介导的细胞毒性。低甲基化基因集富集了抗原呈递和免疫信号基因，包括多个MHC I类和II类基因、抗原加工转运蛋白TAP1和TAP2，以及NK/T细胞信号和干扰素/趋化因子通路基因。尽管全局甲基化水平在TET2突变阳性和阴性病例之间无差异，但差异分析识别出2109个DMR（对应1909个DMG），与对照组相比，TET2突变阳性肿瘤显示出PI3K-Akt信号、IgSF细胞粘附和PD-1/PD-L1检查点通路的富集。
**ENKTL和nodal-TNKL中不同的甲基化景观反映了不同的基因调控机制，并与基因组不稳定性相关**
ENKTL中的大多数超甲基化DMR定位于启动子区域，而nodal-TNKL则在非重复基因组区域（包括启动子、内含子、外显子和基因间区域）显示出广泛的低甲基化。染色质状态注释显示，ENKTL中的DMR主要在启动子相关染色质、抑制性多梳和增强子状态中富集，而nodal-TNKL中的DMR主要在抑制性多梳、转录相关和增强子状态中富集。研究人员观察到全局甲基化水平与GI评分之间存在显著正相关。ENKTL-组2聚集在高甲基化、高GI的一端，而nodal-TNKL样本则表现出较低的甲基化和GI，支持了这些淋巴瘤中DNA超甲基化与GI之间的关联。
**讨论与结论**
本研究全面定义了ENKTL和nodal-TNKL中截然不同的DNA甲基化景观。ENKTL以广泛的启动子中心超甲基化为特征，抑制TSG、发育程序和谱系相关转录调节因子（如LEF1/LEF1-AS1）以及信号调节因子（如BANK1）。相比之下，nodal-TNKL表现出广泛的基因组低甲基化，与免疫激活通路（特别是抗原处理和呈递）相关。重要的是，研究在ENKTL中识别出两个先前未被认识的表观遗传亚组，其中超甲基化亚组（ENKTL-组2）与GI增加和较差生存期相关。这些结果提示，这些实体特异性的表观基因组结构可能反映了不同的疾病进展机制和治疗脆弱性：ENKTL，特别是超甲基化、基因组不稳定的亚组，可能受益于靶向DNA损伤应答通路和表观遗传调节因子的策略；而nodal-TNKL，由于其免疫激活、低甲基化的特征，可能更适合免疫调节方法。总之，这项整合性表观基因组分析区分了ENKTL和nodal-TNKL，细化了ENKTL内的分子亚型，并为利用甲基化特征支持两种淋巴瘤的鉴别、ENKTL的风险分层以及EBV相关T/NK细胞淋巴瘤的理性生物学指导治疗优先排序提供了概念框架。
