高数值孔径共聚焦体积介观显微镜揭示体内中尺度亚细胞动力学

《Nature Biotechnology》：High numerical aperture confocal volumetric mesoscope reveals mesoscale subcellular dynamics in vivo

　　

在哺乳动物中同时捕获数千个细胞的亚细胞动力学仍具挑战性，这源于空间分辨率、视场(field of view, FOV)、成像速度与样本活性之间的权衡，特别是在高数值孔径(numerical aperture, NA)条件下。在此，研究人员设计了一种高NA中尺度物镜，并提出了一种NA为1.05的共聚焦体积介观显微镜RUSH3D-HR，在每秒5体积(volumes per second, VPS)的速度下，于2.7?×?2.0?×?0.04 mm3的体积内实现了约390 nm的分辨率，且光毒性低。通过整合先前开发的共聚焦扫描光场(confocal scanning light-field)框架与并行化深度学习流水线，RUSH3D-HR将实验效率提高了数个量级。以每秒700亿体素(voxels per second)的长期成像可视化了免疫反应，如伤口愈合期间的长距离集体细胞迁移、大规模迁移体(migrasome)生成以及急性肝衰竭期间的中性粒细胞-巨噬细胞相互作用。在脂多糖(lipopolysaccharide, LPS)诱导的炎症期间，对小鼠脾脏超过6000个中性粒细胞进行小时级监测，揭示了瞬态涌现的集群(swarming)行为，而足三里(ST36)的电针刺(electroacupuncture, EA)抑制了该行为，为外周电刺激的免疫调节机制提供了直接证据。

研究背景方面，哺乳动物体内数百万细胞及细胞器持续迁移、互作以形成复杂的群体动力学，驱动生理或病理状态下的多样功能，这些过程难以在体外重现。现有中尺度活体荧光显微技术虽能在原生状态下以单细胞分辨率研究跨哺乳动物器官的宏观细胞互作，但许多疾病进展早期涉及复杂的亚细胞动力学及全器官协调响应，亟需高保真、高通量、亚微米分辨率、毫米级视场且低光毒性的三维体积成像，而高数值孔径下大视场与高分辨率的权衡、浅景深导致的光毒性与背景污染、海量数据处理等系统性工程挑战使其难以实现。为此，研究人员开展了高NA共聚焦体积介观显微镜RUSH3D-HR的研发与应用研究，得出该系统突破现有技术瓶颈并实现多项活体免疫动力学观测的结论，具有重要意义，相关论文发表在《Nature Biotechnology》。

关键技术方法方面，研究人员定制了NA 1.05、视场2.8 mm的Kunlun非远心物镜，采用全路径光学优化；集成共聚焦扫描光场框架与线共焦策略实现40 μm轴向光学层切成像；开发基于GPU并行的深度学习流水线，含运动校正、波前数字自适应光学(wave-optics digital adaptive optics, wDAO)多位点像差校正、自监督去噪及物理驱动自监督重建网络(SeReNet)；样本来源于雄性野生型C57BL/6J小鼠，构建皮肤损伤、对乙酰氨基酚(acetaminophen, APAP)急性肝衰竭、LPS诱导脾炎症模型及ST36电针刺干预模型。

研究结果方面，RUSH3D-HR原理部分，研究人员通过Kunlun物镜提升横向空间带宽积(space–bandwidth product, SBP)约十倍，结合wDAO计算校正像差，利用扫描光场实现高速体积采集与低光毒性，线共焦配置以滚动快门作虚拟狭缝拒背景荧光；开发并行AI流水线，将原始图像分35子视场处理，集成运动伪影校正、去噪、多位点像差校正与多GPU并行SeReNet重建，较反卷积快千倍以处理每秒700亿体素吞吐。系统表征与基准测试部分，通过荧光微球与傅里叶环相关(Fourier ring correlation, FRC)验证全视场均匀近衍射极限分辨率，经wDAO校正后横向约381?±?42 nm、轴向约707?±?50 nm，有效轴向40 μm；共焦模块使信背比(signal-to-background ratio, SBR)达19.5?±?0.8 dB，较宽场提升约15 dB；扩展景深约40 μm，激光强度约1 mW mm^?2下连续3小时无光漂白，验证高保真与低光毒性。伤口愈合期间集体长距离细胞迁移监测部分，研究人员对小鼠背部真皮轻微损伤后超10小时成像，在2.7?×?2.0?×?0.04 mm³内同步监测伤口及周边集体迁移，追踪近20000中性粒细胞呈网状迁移模式，部分在达伤口前局部聚集，亚细胞分辨率可视化多样细胞形态与姿态转换。病理状态下细胞器相关罕见模式探究部分，研究人员以三色RUSH3D-HR在5 VPS下连续观察APAP肝衰竭小鼠肝脏血管内中性粒细胞与巨噬细胞，全视场下单次实验常规观测迁移纤维与迁移体等罕见事件，APAP组迁移体累积数约增六倍，中性粒细胞速度升高，迁移体运动性从0.13 μm s^?1升至0.29 μm s^?1，超70%迁移体形成后能量增强，且迁移体可被中性粒或巨噬细胞吞噬，揭示病理下迁移体介导细胞通讯上调。小鼠脾脏炎症期间中性粒细胞瞬态涌现集群部分，研究人员在LPS诱导炎症3小时后成像，全视场捕捉随机分布中性粒细胞瞬态集群行为，追踪超6000细胞5小时，LPS组细胞数增约30%、速度从3.53 μm s^?1升至3.80 μm s^?1，集群频率从约2次增至约20次；高分辨率解析聚集时向中心向心迁移，组装时加速、离散时减速，峰值速达正常两倍，每集群持续20–180分钟、覆盖约1000–4000 μm²，分类为集群、迁移与滞留细胞。基于中尺度生物标志物验证电针刺抗炎部分，研究人员以LPS诱导炎症2.5小时后予ST36电针刺(0.5 mA)，3小时后成像，发现电针刺使集群事件降五倍以上，无电刺激针刺无抑制效果，证实ST36电针刺有效抑制LPS炎症，中性粒细胞集群可作中尺度生物标志物直接评估外周干预疗效。

讨论部分总结，疾病复杂性由组织空间异质性与时间异质性驱动，RUSH3D-HR提供时空域高保真全景视图，解决哺乳动物毫秒级三维活体观测大尺度细胞互作在亚细胞分辨率下的未满足需求，协同高NA宽视场物镜、共聚焦扫描光场及端到端并行深度学习实现。RUSH3D-HR较此前RUSH3D提升分辨率至0.39?×?0.39?×?0.7 μm³，视场为2.7?×?2.0?×?0.04 mm³，Kunlun物镜NA 1.05、放大倍率×20，定制微透镜阵列(microlens array, MLA)每单元对应15?×?15像素以保障角分辨率；当前局限为快照有效轴向覆盖与分辨率权衡、单光子激发穿透深度受限、可结合波前编码扩深或双光子激发、可融结构光照明显微术(structured illumination)获超分辨、四光谱通道可拓展高光谱等；RUSH3D-HR提供亚细胞中尺度平台，关联单细胞微观亚细胞动力学与器官级宏观功能以研究体内细胞互作。

研究结论翻译部分，RUSH3D-HR提供了一种亚细胞中尺度成像平台，以关联每个单细胞内的微观亚细胞动力学与器官级宏观功能，用于研究体内的细胞间相互作用。

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