寡核苷酸-siRNA偶联物用于SOD1肌萎缩侧索硬化症：一项1期试验

《Nature Medicine》：Oligonucleotide–siRNA conjugate for SOD1 amyotrophic lateral sclerosis: a phase 1 trial

　　

肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致死性神经退行性疾病，部分由超氧化物歧化酶1（SOD1）的功能获得性突变引起。研究人员开发了RAG-17，一种靶向SOD1的siRNA，利用辅助寡核苷酸（ACO）偶联平台以增强中枢神经系统（CNS）递送。临床前研究显示，RAG-17可挽救SOD1^G93A ALS啮齿类动物的运动神经元变性、延缓疾病进展、保护运动功能并延长生存期，即使在晚期治疗时也有效。在食蟹猴中，鞘内注射RAG-17导致SOD1 mRNA（CNS）和蛋白（脑脊液（CSF））呈剂量依赖性、持久性降低。在一项针对SOD1-ALS患者（n=6）的首个人体试验中，受试者被分配到两个队列——队列1（n=3）接受初始60 mg剂量（共7次给药），队列2（n=3）接受初始90 mg剂量（共6次给药）。剂量以30 mg递增至维持剂量150 mg（n=5）或180 mg（n=1）。主要安全性终点达到，显示可接受的安全性和耐受性。治疗中出现的不良事件（TEAEs）发生在33%的受试者中（6例中的2例）。所有TEAEs均为轻至中度，包括肌肉震颤（2例患者）和丙氨酸氨基转移酶升高（1例患者），均已消退。未报告严重不良事件。此外，在实验室参数、生命体征、ALS功能评定量表-修订版（ALSFRS-R）评分、体格或神经系统检查或心电图（ECG）中未观察到其他临床有意义的变化。关键次要终点显示，CSF SOD1蛋白降低69%（队列1，第240天）和56%（队列2，第210天），血浆神经丝轻链（NfL）降低62%（队列1）和52%（队列2），均相对于基线；无患者需要有创机械通气或死亡。这些结果显示了良好的安全性结局，支持RAG-17用于SOD1-ALS的继续临床评估。临床试验注册号：NCT05903690。

**论文解读：RAG-17——靶向SOD1的siRNA偶联物在肌萎缩侧索硬化症中的临床前与1期临床研究**

**研究背景**
肌萎缩侧索硬化症（ALS）是一种致死性神经退行性疾病，以运动神经元（MNs）进行性丢失为特征。由于发病机制不明，治疗选择十分有限。超氧化物歧化酶1（SOD1）基因突变是关键的遗传病因，占家族性ALS的15-30%及所有病例的2%（亚洲人群比例更高）。这些突变通过“功能获得性”机制产生毒性错误折叠的SOD1蛋白，驱动MN变性。因此，降低突变SOD1表达是亚组患者的合理治疗策略。反义寡核苷酸（ASO）tofersen已基于显著降低神经丝轻链（NfL）而加速获批，但单链ASO依然存在递送与安全性方面的局限。小干扰RNA（siRNA）通过RNA干扰（RNAi）实现强效持久的基因沉默，但有效递送至中枢神经系统（CNS）是主要挑战。为此，研究人员开发了Smart Chemistry Aided Delivery（SCAD）平台，将治疗性siRNA与辅助寡核苷酸（ACO）偶联，以促进细胞摄取和组织分布。前期研究显示RAG-17（一种SCAD–siRNA）在SOD1^G93A小鼠中表现出显著疗效。本研究全面评估RAG-17的临床前特征与人体试验结果，旨在为SOD1-ALS提供新的治疗选择。该论文发表于《Nature Medicine》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用SCAD平台合成RAG-17（siRNA-ACO偶联物）。关键方法包括：通过血清稳定性实验评估寡核苷酸稳定性；利用RNAscope原位杂交（ISH）和液相色谱串联质谱（LC-MS/MS）在啮齿类动物中分析组织分布与清除；在SOD1^G93A小鼠和大鼠中通过脑室内（ICV）或鞘内注射评估疗效，使用旋转杆、握力等行为学检测和生存曲线；在食蟹猴中通过鞘内注射进行药代动力学（PK）和药效学（PD）分析，采用RT–qPCR和ELISA分别检测SOD1 mRNA和蛋白水平；开展一项开放标签、单中心、剂量递增的1期人体试验（CREATION），纳入6例SOD1-ALS患者（来自中国），接受递增剂量鞘内注射。样本队列来源包括：Jackson Laboratory的转基因小鼠、Taconic Biosciences的转基因大鼠、Guangdong Blooming-Spring的食蟹猴，以及北京天坛医院的人体受试者。受试者入组标准包括确诊SOD1突变、FVC≥50%预计值等。主要终点为安全性；次要终点包括CSF SOD1、血浆NfL、PK和机械通气/死亡时间。

**研究结果**
**1. RAG-17的体外稳定性、二级药理学和免疫原性分析**
与人类血清孵育显示，RAG-17自第1天起逐渐释放双链siRNA，而ACO组分大部分保持结合，表明具有足够的稳定性以支持组织分布和后续分离。计算机预测及RT–qPCR验证显示，在0.25 nM至25 nM浓度下，RAG-17对候选脱靶基因（CYTH2、NDUFC2、DISP2、KNOP1、UBAP2L）mRNA水平无显著影响。ELISA检测表明，RAG-17及其双链或ACO组分均不诱导人外周血单核细胞（PBMCs）中干扰素（IFN）-α、肿瘤坏死因子（TNF）或白细胞介素（IL）-1β的表达。

**2. 啮齿类动物中鞘内注射RAG-17的生物分布与清除**
RNAscope原位杂交显示，RAG-17在大鼠CNS中广泛分布，以注射部位附近的腰椎脊髓浓度最高；脑内嗅球、海马和小脑水平高于其他区域。LC-MS/MS证实，脊髓（尤其腰段）浓度最高，脑干、小脑、海马和大脑水平相当，纹状体最低。CNS浓度在最初7天迅速下降后趋于稳定，而肝、肾浓度持续快速下降。清除半衰期：肾脏和肝脏为6-9天，CNS组织为20-27天。

**3. 发病后给予RAG-17挽救SOD1^G93A小鼠肌力并延长生存期**
在雌性SOD1^G93A小鼠（症状通常在PND 90-100出现）于PND 126和151给予两次ICV注射（200或400 μg）的晚期治疗中，RAG-17剂量依赖性地改善运动性能、肌力和体重。与对照组（中位生存169.5天）相比，200 μg和400 μg晚期治疗分别延长生存期78.5天（46.3%）和128.5天（75.8%）。早期治疗（PND 70/100）中位生存331天（95%延长），但晚期治疗仍保留显著疗效。

**4. RAG-17延迟SOD1^G93A ALS大鼠发病、延长生存并改善运动功能**
SOD1^G93A大鼠在PND 70和130接受两次鞘内注射0.9 mg RAG-17或非靶向对照（NTC）。RAG-17显著延迟发病（NTC中位发病187.5天，RAG-17组至290天研究终点未达中位发病），维持体重、肌力、运动功能，延迟瘫痪并延长生存。腰椎脊髓胆碱乙酰转移酶（ChAT）染色显示，RAG-17显著保护MNs（较NTC增加42.2%，P=0.0409），但未恢复至野生型水平。

**5. RAG-17在食蟹猴中展现强效持久的CNS SOD1敲低**
尽管RAG-17反义链与食蟹猴SOD1 mRNA在第13位有一个核苷酸错配，但在COS-1细胞中敲低效率与人类T98G细胞相当。鞘内注射后，RAG-17呈现剂量依赖性暴露，CSF浓度远高于血浆（CSF/血浆比200-900）。PD分析显示，50 mg剂量使腰髓SOD1 mRNA降低91%，效果持续至72天；大脑皮层敲低活性在20 mg时达40%，50 mg时超过70%。mRNA降低与CSF SOD1蛋白水平下降一致。PK/PD整合分析得出腰骶髓ED₅₀为3.889 mg（第22天）和5.031 mg（第71天），大脑皮层ED₅₀为51.37 mg和108.4 mg；IC₅₀分别为165.2 ng g^-1和376.1 ng g^-1。

**6. 人体临床试验设计、受试者分布与基线特征**
这是一项开放标签、单中心、剂量递增试验，纳入6例SOD1-ALS成人患者（4例女性，年龄26-67岁）。队列1（n=3）初始60 mg，队列2（n=3）初始90 mg，以30 mg递增至维持剂量150 mg（n=5）或180 mg（n=1）。共完成6-7次鞘内注射。所有受试者均完成治疗和研究访视。基线特征包括ALSFRS-R评分、FVC%、血浆NfL等。

**7. 人体临床试验主要结局（安全性）**
RAG-17总体耐受良好，至数据截止无严重不良事件（SAEs）。TEAEs发生于33%受试者（2/6）：病例1和2在初始剂量后出现短暂轻度肌肉震颤，自行消退；病例1（既往脂肪肝）出现无症状ALT升高（>1.5倍基线），继续治疗后未进一步升高。其他AE包括头痛（n=2）、跌倒（n=2）等，考虑与操作或ALS进展相关，与研究药物无关。无临床有意义的实验室参数、生命体征、体格/神经系统检查或ECG变化。ALSFRS-R评分个体波动，预处理进展率估计0.430±0.172分/月，治疗后为0.295±0.187分/月；基于基线严重程度和病程的不同亚组呈现异质性反应。

**8. 人体临床试验次要结局**
PK分析显示，血浆RAG-17浓度通常在注射后6-12小时达峰，48小时恢复至基线。两名受试者在特定时间点出现早期峰值，但CSF SOD1蛋白降低一致。所有受试者CSF SOD1蛋白水平逐步且显著下降：队列1平均降低69%（第240天），队列2平均降低56%（第210天）。血浆NfL水平下降：5/6受试者达50-85%的个体最低点；队列1平均降低62%（第240天），队列2平均降低52%（第210天）。NfL下降在维持期出现轻微反弹，但仍远低于基线。无患者需要有创机械通气或死亡。

**9. 人体临床试验探索性结局**
肺功能（%FVC）在多数组延迟恶化；肌力评估无显著下降；生活质量量表（ALSAQ-40、EQ-5D-5L）略有下降；焦虑（HAMA）、抑郁（HAMD）、疲劳（FSS）评分变化不大；肌电图参数缓慢变化；步态功能变化极小或逐渐下降；临床分期在4例受试者中保持稳定，2例出现进展。基线7T MRI SWI显示3/6受试者存在运动带征，研究期间无明显变化。

**讨论与结论**
讨论指出，RAG-17作为基于SCAD平台的siRNA-ACO偶联物，在体外、啮齿类、非人灵长类及人体中均展现了靶点结合与药理活性。鞘内给药降低CSF SOD1蛋白和血浆NfL水平，其幅度与tofersen报告范围相当。RAG-17给药频率可能更低（NHP中mRNA敲低持续71天）。在晚期疾病小鼠模型中，RAG-17仍产生前所未有的生存获益，提示对快速进展型ALS的潜在价值。安全性方面，未观察到炎症或神经毒性AE，可能与较短的寡核苷酸长度（14-核苷酸ACO）有关。局限性包括开放标签设计、样本量小、SOD1突变异质性、缺乏连续CSF细胞数据等。结论：RAG-17——一种SCAD递送的siRNA，在临床前模型中展现强效SOD1沉默和疗效。在其人体临床试验中，达到了主要安全性终点，在所测试剂量下显示可接受的安全性和耐受性。RAG-17为SOD1-ALS提供了额外的治疗选择，并验证了SCAD平台用于下一代神经系统疾病RNAi疗法。