《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Targeting the microglial phosphatidylethanolamine synthesis pathway promotes GABARAP-associated phagocytosis and Aβ clearance in Alzheimer’s disease
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阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是痴呆的主要病因，也是一种普遍的与年龄相关的神经退行性疾病，以进行性认知损害和记忆丧失为特征。尽管小胶质细胞的代谢激活或功能障碍与AD发病相关，但小胶质细胞内磷脂代谢相关信号机制仍不明确。研究人员证
阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease, AD）是痴呆的主要病因，也是一种普遍的与年龄相关的神经退行性疾病，以进行性认知损害和记忆丧失为特征。尽管小胶质细胞的代谢激活或功能障碍与AD发病相关，但小胶质细胞内磷脂代谢相关信号机制仍不明确。研究人员证实，色氨酸经犬尿氨酸通路代谢的副产物喹啉酸（quinolinic acid, QA）通过上调酶EPT1和ETNK1，激活负责从头合成磷脂酰乙醇胺（phosphatidylethanolamine, PE）的小胶质细胞Kennedy通路，显著增强富含多不饱和脂肪酸的PE种类合成。同时，QA显著增加γ?氨基丁酸受体相关蛋白（gamma?aminobutyric acid receptor–associated protein, GABARAP）的表达，促进其脂化，并助力小胶质细胞对Aβ寡聚体的GABARAP相关吞噬（GABARAP?associated phagocytosis, GAP）。敲低EPT1和ETNK1减弱了QA诱导的PE合成并损害Aβ寡聚体的GAP，而通过STBD1去偶联酶抑制GABARAP脂化则大幅降低QA介导的GAP。在AD（5xFAD）小鼠海马中，QA给药上调小胶质细胞Gabarap表达并减少Aβ斑块负荷，而Gabarap敲低消除了QA诱导的小胶质细胞对Aβ的清除。综上，这些发现揭示了QA在激活小胶质细胞特异性信号级联中的矛盾有益作用，该级联促进PE生物合成和GAP，从而增强Aβ清除并减轻AD病理。靶向小胶质细胞PE合成通路和GAP可能代表一种有前景的治疗策略，以改善Aβ积累并延缓AD进展。
研究背景方面，阿尔茨海默病（AD）是以淀粉样β（Aβ）斑块与tau神经原纤维缠结为核心病理的衰老相关神经退行性疾病，慢性神经炎症在其发生发展中起关键作用。小胶质细胞作为脑内主要免疫细胞，在AD早期即被激活，但其从稳态向疾病相关表型转变、丧失保护能力的具体机制尚未明确。既往研究多关注色氨酸?犬尿氨酸通路代谢产物喹啉酸（QA）作为内源性神经毒素通过NMDA受体介导兴奋毒性和氧化应激加重AD病理，而QA对小胶质细胞吞噬功能的调控及其与磷脂代谢的关系尚属未知。脂质代谢尤其是磷脂酰乙醇胺（PE）合成与小胶质细胞免疫功能的关联也缺乏系统阐释。鉴于AD脑内QA水平升高且与认知损害程度相关，研究人员拟探究QA是否通过调节小胶质细胞代谢重编程影响Aβ清除，从而明确其在AD微环境中除神经毒性外的潜在适应性作用，为靶向小胶质细胞代谢治疗AD提供新依据。该研究发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
为开展研究，研究人员主要采用以下关键技术方法：使用人小胶质细胞系HMC3及原代小鼠小胶质细胞作为体外模型，以5xFAD和APP/PS1转基因小鼠为体内AD模型；通过非靶向脂质组学（UPLC?Orbitrap?MS/MS）分析PE物种变化；利用单细胞RNA测序（scRNA?seq）解析QA激活的小胶质细胞转录特征，并与AD患者死后脑单细胞数据集（Olah等、GSE125050）交叉验证；借助慢病毒shRNA敲低ETNK1、EPT1、GABARAP及AAV?shGabarap体内敲低技术阻断Kennedy通路与GAP；采用时间分辨活细胞成像结合pHrodo?Aβ示踪吞噬与溶酶体处理过程；使用STBD1?deconjugase与FYCO1?deconjugase选择性抑制ATG8家族蛋白脂化；通过免疫荧光、扫描与透射电镜观察细胞形态及超微结构；结合qPCR、Western blot检测通路分子表达及脂化水平；利用立体定位注射QA、美克洛嗪（meclizine）等进行体内药理干预与病理评估。样本队列包括人死后额叶皮层正常与AD脑组织、5xFAD及APP/PS1小鼠海马与皮质组织。
研究结果部分依次如下：
Quinolinic acid (QA) increases PE synthesis via the Kennedy pathway in microglia：研究人员通过时间梯度qPCR发现QA选择性上调小胶质细胞ETNK1与EPT1而非PCYT2的mRNA表达；非靶向脂质组学主成分分析显示QA处理组PE物种显著富集，敲低ETNK1或EPT1可逆转该变化；人AD脑微胶质中ETNK1与EPT1表达高于正常对照，免疫组化显示AD脑IBA1阳性小胶质内EPT1增加；扫描电镜显示QA提高小胶质细胞表面粗糙度与膜复杂性，表明Kennedy通路激活促进PE合成并重塑膜动态。
Modulation of the Kennedy pathway regulates QA?induced phagocytosis of Aβ oligomers in microglia：遗传敲低EPT1或ETNK1削弱QA增强的pHrodo?Aβ摄取强度与颗粒大小；药理抑制PEMT的bezafibrate扩大PE池并协同QA提升吞噬，而PCYT2抑制剂meclizine减少QA诱导的PE合成并阻断zymosan与Aβ吞噬；透射电镜显示meclizine减少QA诱发的单膜吞噬体与双膜自噬体样结构，证实Kennedy通路PE合成是QA促进吞噬的必要条件。
QA?mediated Kennedy pathway activation provides neuroprotection and reverses AD?like pathology in vivo：在5xFAD小鼠海马立体定位注射QA后1天Aβ斑块体积减少约55%，效应持续至30天； bulk RNA?seq显示QA使疾病基因表达向野生型偏移，下调炎症通路、上调神经元与膜功能相关基因；QA上调脑内IBA1小胶质中ETNK1与EPT1，增加小胶质分支点；共注射meclizine取消QA的斑块减少与形态活化效应，电镜证实meclizine阻断QA诱导的超微结构改变，表明体内Kennedy通路介导QA的有益作用。
Single?cell transcriptome analysis reveals overlapping gene signatures between in vitro QA?exposed microglia and AD postmortem brain?derived microglia：scRNA?seq UMAP聚类显示QA处理引发小胶质细胞群动态变化，cluster g显著富集自噬、吞噬、脂质生物合成相关GO条目；与Olah等AD人脑微胶质数据比对发现300个上调基因重叠，CCA分析显示显著相关；重叠基因富集细胞骨架组织与PE脂化相关过程，且ETNK1、EPT1在QA组特异上调，提示体外QA激活特征与AD体内微胶质有部分共性。
GABARAP lipidation is required for the QA?induced phagocytosis of Aβ particles in microglia：活细胞成像显示QA促使GABARAP?mCherry向胞膜外周聚集且运动速度加快，LC3B?GFP响应较弱；表达STBD1?deconjugase或FYCO1?deconjugase阻断GABARAP脂化后，QA诱导的GABARAP重新分布与速度增加被消除，ATG8脂化水平（GABARAP?PE、LC3B?PE）上升被抑制；3?MA、氯喹等自噬抑制剂仅部分减弱QA吞噬，表明QA主要依赖GABARAP脂化而非经典自噬通路执行GAP。
QA upregulates GABARAP expression and lipidation in microglia and AD models, promoting Aβ oligomer phagocytosis：qPCR显示QA早期即上调GABARAP mRNA且持续至12小时，LC3B在6–12小时才上调；Western blot证实QA增加可溶性及脂化GABARAP?PE，meclizine降低其脂化；人AD脑皮质与5xFAD小鼠海马IBA1小胶质中GABARAP免疫活性高于对照，QA注射进一步增加小鼠内GABARAP强度，meclizine减弱该信号；原代小胶质中QA增加GABARAP斑点并促外周分布，meclizine抑制之，说明QA?Kennedy?GABARAP轴在体与离体均成立。
QA?induced microglial activation reduces Aβ plaque formation via GAP in AD mice：体外活细胞成像显示shGABARAP敲低既降低基线Aβ吞噬也取消QA增强的吞噬；体内AAV?shGabarap注射至APP/PS1小鼠海马增加皮质与海马Aβ斑块体积，缩减小胶质分支点与胞体周长；QA与AAV?shGabarap共注射时，QA的斑块减少效应被Gabarap敲低抵消，确证GAP是QA清除Aβ的关键机制。
讨论部分总结：研究人员指出既往将QA视为单纯神经毒素的观点忽略了其对小胶质细胞的特异性信号作用，本研究揭示在急性低剂量下QA通过Kennedy通路促进PE合成、增强GABARAP脂化与GAP，形成“QA?Kennedy?GABARAP?Aβ清除”轴，在5xFAD小鼠中降低斑块、短暂下调p?Tau AT8、改善突触密度与认知，体现毒理学的hormesis特征。该通路与经典LC3相关吞噬不同，GABARAP优先定位于质膜并动态转运，而LC3B偏核周静态。研究亦承认模型未能完全模拟人类慢性AD的tau病变与神经元丢失，长期GABARAP脂化与自噬通量尚需后续探讨。结论部分译为：总之，研究人员确定了此前未被认识的小胶质细胞特异性信号轴，其中QA激活Kennedy通路依赖性PE生物合成，增强GABARAP脂化并促进高效的Aβ吞噬。这项工作揭示了代谢信号与小胶质细胞吞噬装置之间的直接机制联系，将QA重新定义为AD微环境中小胶质细胞功能的情境依赖性调节因子。这种代谢适应可能在维持细胞稳态和减轻AD相关神经病理中发挥重要作用。研究发现提示，靶向小胶质细胞脂质代谢与GABARAP依赖性吞噬通路是AD的颇有前景的治疗策略。
