《Signal Transduction and Targeted Therapy》：Multiomic profiling of responses to clinical and novel bisphosphonates reveals extraskeletal effects on ageing related signatures
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双膦酸盐（Bisphosphonates，BPs）已被有效用于治疗过度骨丢失超过50年。近期临床证据表明其具有骨骼外获益，但该现象的发生机制尚不清楚。研究人员利用人、小鼠及细胞层面的评估体系，绘制BP诱导的全身及局部器官部位衰老相关变化图谱。在经唑来膦酸（Zo
双膦酸盐（Bisphosphonates，BPs）已被有效用于治疗过度骨丢失超过50年。近期临床证据表明其具有骨骼外获益，但该现象的发生机制尚不清楚。研究人员利用人、小鼠及细胞层面的评估体系，绘制BP诱导的全身及局部器官部位衰老相关变化图谱。在经唑来膦酸（Zoledronate，ZOL）治疗的老年小鼠中进行体内空间转录组学分析显示，心脏、肝脏及肠道的细胞组成特异性地向年轻动物偏移，解毒、线粒体稳定性、能量代谢及抗氧化相关调控基因上调。基于5000重随机试验的人蛋白质组学分析显示，ZOL治疗后约400种蛋白质发生显著改变，与基因组不稳定性、蛋白稳态丧失、线粒体功能障碍、干细胞耗竭及衰老相关分泌表型（Senescence-Associated Secretory Phenotype，SASP）相关的蛋白质下调。荧光标记与示踪证实了非骨骼细胞对双膦酸盐的摄取。此外，多种常用临床BPs的低剂量处理刺激了多种人类细胞类型的生长并防护DNA损伤诱导的衰老，其中在心肌细胞中效应最强。最后，利用AlphaFold进行蛋白质组范围的靶点解卷积鉴定出先前未被识别的结合伴侣，包括PHB2与ASAH1，并验证了下游MEF2A的上调是ZOL触发心肌细胞获益的关键介导因子。综上，这些结果确定了BP在多种非骨骼组织中发挥潜在老年保护（Geroprotective）作用的机制。
该研究背景源于双膦酸盐作为治疗过度骨丢失的经典药物已应用五十余年，近期临床观察发现其能降低患者死亡率并减少心血管、呼吸系统等衰老相关疾病发生，提示存在超越骨骼系统的额外获益，但相关非骨骼作用机制完全未知。传统观点认为BPs仅作用于矿化表面的破骨细胞，然而已有零星证据显示单核细胞、内皮细胞等非骨骼细胞亦可摄取BPs，且其可能通过甲羟戊酸途径影响炎症、氧化应激等衰老相关过程，但缺乏系统性的多组学整合证据及明确的分子靶点解析。为此，研究人员开展跨物种、多层面的整合研究，旨在揭示BPs在非骨骼组织中的分布、对衰老特征的调控及潜在的分子机理，最终确定BPs具备潜在的老年保护机制，为拓展其临床应用提供理论依据。该论文发表于《Signal Transduction and Targeted Therapy》。
研究人员为开展研究用到的主要关键技术方法包括：基于新西兰一项随机对照试验的36例65岁以上骨质减少女性患者队列，在基线、ZOL输注后18及36个月采集血浆，利用SomaScan平台（约5000重）进行蛋白质组学检测；选用6只2月龄年轻雌性C57BL/6 N小鼠与12只22月龄老年雌性小鼠，其中老年鼠分组给予Vehicle或125 μg/kg ZOL治疗2月，取肝、心、肠等7种器官组织制备组织微阵列，通过NanoString GeoMx数字空间分析仪进行空间转录组测序；利用荧光标记的RIS（ROX-RIS）与ZOL（FAM-ZOL、ATF-ZOL）处理HUH-7、AC-16等多种非骨骼来源人源细胞系，共聚焦显微镜观察亚细胞定位；对AC-16心肌细胞施加0.001 μM ZOL处理，结合2D热蛋白质组学（2D Thermal Proteome Profiling）与质谱分析、AlphaFold分子对接及CETSA-WB验证靶点；通过IncuCyte活细胞成像监测细胞汇合度，配合SA-β-Gal染色、流式细胞术细胞周期分析及Western blot检测衰老标志物评估DNA损伤诱导的衰老模型；整合ATAC-seq与RNA-seq进行跨组学调控网络解析。
Bisphosphonate treatment is associated with reduced disease progression and severity
研究人员汇总全球多项骨丢失相关随机对照试验及临床前研究证据，发现BP治疗与骨骼外致死事件减少相关，其中利塞膦酸钠（Risedronate，RIS）测试频率最高（34.44%），唑来膦酸（ZOL，23.77%）显示最显著的获益，伊班膦酸钠（IBN，24.2%）与阿仑膦酸钠（ALN，17.59%）亦有贡献，主要涉及女性队列。描述性总结显示BP治疗关联多器官疾病结局改善，涵盖心血管疾病、多种癌症、糖尿病、神经退行性疾病、听力丧失、遗传性早衰综合征、寄生虫感染及风湿性疾病等，提示BP具有广泛的潜在非骨骼临床价值。
Zoledronate treatment alters plasma proteome in female osteopenic patients
研究人员分析上述新西兰队列中女性骨质减少患者接受ZOL（5 mg）输注前及后18、36个月的血浆蛋白质组，发现治疗后显著数量的循环蛋白质水平改变，最高调控个体蛋白包括KLC1、FER、TMOD2等。大量改变蛋白与Human Ageing Genomic Resources（HAGR）数据库中的衰老相关特征相关，表现为基因组不稳定性、蛋白稳态丧失、营养感应失调、线粒体功能障碍及干细胞耗竭相关标志物下调；同时鉴定出衰老相关分泌表型（SASP）组分（如IL-6、NF?B、STAT3、CDKN1A、CDKN2D）下调，基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）显示ZOL下调蛋白显著富集于细胞衰老与脑老化相关通路，表明ZOL在中老年女性中具有seno-modifying潜力。
Zoledronate induces localised transcriptomic changes in ageing-related pathways in vivo
研究人员对22月龄雌性小鼠经ZOL（125 μg/kg，2月）处理后的8种非骨骼组织进行空间转录组分析，UMAP显示各器官具独特转录谱，ZOL处理显著改变肝脏与心脏转录轮廓。肝脏中差异表达基因（Differentially Expressed Genes，DEGs）上调富集于过氧化物酶体β-氧化、解毒、能量平衡及色氨酸代谢，下调富集于炎性衰老（Inflammaging）与复制应激；心脏中上调基因涉及脂肪酸β-氧化、线粒体产能、氧化还原稳态，下调关联血管重塑与应激；肠道中脂质与胆固醇代谢通路下调，肺中脂蛋白转运与类固醇合成富集。跨肝、心、脾、肠共53个DEGs映射至HAGR，含15个上调的衰老获益相关基因（脂肪酸β-氧化、过氧化物酶体生物发生、抗氧化等）。细胞解卷积显示老年小鼠心、肝、肠的细胞组成在ZOL给药后向年轻动物偏移。
Bisphosphonate uptake and distribution in non-skeletal cells
研究人员利用荧光标记RIS（ROX-RIS）与ZOL（FAM-ZOL、ATF-ZOL）及细胞器标记物共聚焦成像，证实BPs可被多数非骨骼人源细胞摄取，心、肾、肝细胞摄取效率最高，且BPs偏好定位于溶酶体与内体（Pearson相关系数验证），提示BPs可能影响细胞内蛋白质量控制、修饰及自噬相关过程，突破了BPs仅作用于破骨细胞的传统认知，揭示其更广泛的非骨骼细胞可及性与潜在胞内靶点。
Bisphosphonates induce contrasting dose-dependent effects on cell growth
研究人员以低（0.001 μM）、中（0.1 μM）、高（10 μM）剂量七种典型BPs（含非含氮CLO、ETI及含氮ZOL、RIS、ALN、OX14、IG9402）处理多组织来源人源细胞，活细胞成像显示高浓度（10 μM）抑制多数细胞生长（类比破骨细胞凋亡效应），而低浓度（<0.01 μM）刺激细胞生长。低剂量ZOL显著促进心肌细胞（28%）、心血管内皮（9.4%）、肾上皮（20.5%）、肝细胞（22%）、成肌细胞（8.7%）及单核细胞（21.1%）增殖，RIS与非含氮CLO亦呈类似效应，提示不同机制BPs均可能通过联合或新机制在低剂量下发挥有益作用。
Bisphosphonates protect against induction of DNA damage-related senescence
研究人员以低剂量（0.001 μM）BPs预处理HUH-7、AC16、HL-1、HEK、THP1细胞后，用丝裂霉素C（Mitomycin C，MMC）诱导DNA损伤性衰老，发现CLO、RIS、ZOL预处理防护细胞汇合度下降，其中心肌细胞防护最强；显著减少γ-H2AX、LaminB1、P16、IL6、TNF-α等衰老标志物表达，缓解细胞周期阻滞与SA-β-Gal阳性染色，表明低剂量BPs在多类型非骨骼细胞中具备抗DNA损伤诱导衰老的senomodifying效应。。
Global profiling of Zoledronate-binding proteins
研究人员优先选择ZOL进行2D热蛋白质组学分析，在AC-16心肌细胞中确认已知靶点法尼基焦磷酸合酶（Farnesyl Pyrophosphate Synthase，FPPS）热稳定性显著升高（ΔTm=17.38 °C）。质谱结合TP-MAP鉴定8397个蛋白中FPPS为最高得分稳定蛋白，同时发现ASAH1、PHB2、FOSL1为ZOL显著稳定的新候选靶点；AlphaFold分子对接显示ASAH1（?11.18 kcal/mol）、PHB2（?7.34 kcal/mol）具较高结合亲和力，CETSA-WB验证PHB2（ΔTm=12.15 °C）、ASAH1（ΔTm=12.13 °C）、FOSL1（ΔTm=2.09 °C）的热稳定性改变，确立其为ZOL此前未识别的直接结合伴侣。
Cross-omics identified PHB2-MEF2A axis in Zoledronate-induced cellular effects in cardiac tissue
研究人员对ZOL（0.001 μM，4天）处理的AC-16细胞行RNA-seq与ATAC-seq，整合STRING数据库构建源自PHB2与ASAH1的蛋白互作网络，交叉映射至人血浆蛋白质组数据集，筛选出ESR1、MEF2A、JUN、KLF4四个潜在下游调节因子，Western blot仅验证MEF2A蛋白持续上调。小鼠心脏转录组与血浆蛋白质组中MEF2A靶基因（Corin、Ablim1、Nduf10等）及相关蛋白（HMBS、BPGM、HIST2H2BE）亦上调；PHB2敲减降低MEF2A水平，MEF2A敲减废除ZOL促生长效应及对MMC诱导衰老的防护作用，确定PHB2-MEF2A轴为ZOL介导心肌细胞获益与抗衰的关键通路。
讨论部分总结指出，BPs通过钙结合与抑制破骨细胞FPPS构成主要骨骼作用，但本研究揭示其在多组织中引发基因组与蛋白质组改变，涉及免疫调节、炎症因子重塑及自噬相关溶酶体活动，与γδ T细胞激活及SLC37A3-ATRAID转运复合物介导的胞内释药相符。微摩尔BPs促肿瘤细胞自噬性死亡部分依赖甲羟戊酸途径抑制，但不可完全被代谢物挽救，提示存mTOR等其它机制；低剂量BPs防DNA损伤衰老与SASP具senomodifying效应，但标准输注难达非骨骼组织长效低浓度，需新型递送策略。通过AlphaFold与多组学发掘PHB2（线粒体支架、长寿相关）与ASAH1（溶酶体鞘脂代谢酶）为新靶点，ZOL结合PHB2激活MEF2A（心肌发育与抗衰老转录因子）构成保护轴，MEF2A缺失致血管内皮衰老，其激活改善衰老相关功能衰退。本研究限于女性临床样本与雌性小鼠，体外细胞未见性别差异但需大样本男性和性别分层验证；高骨亲和与快速清除致非骨骼组织BPs蓄积检测难，体外摄取不等同体内分布；低剂量促生长存异常细胞刺激风险，但体外简化系统缺免疫监视等体内制约，且骨髓瘤等骨侵袭瘤局部高浓度仍具细胞毒，尚无确证BPs影响癌进展的临床证据；心脏响应最显著，PHB2与ASAH1或非RIS、ALN主要靶点，ZOL结合谱因细胞类型蛋白组异质性而异。综上，研究全面解析BPs超越保骨健康的效应，其对衰老通路、细胞衰老及器官细胞群年轻化重塑提供新治疗可能，揭示FPPS依赖与新独立机制共同介导BPs对抗衰老相关疾病的获益。
研究结论部分翻译总结为：研究人员的研究全面分析了BPs在维持骨健康传统用途之外的效应，其对衰老通路细胞衰老血浆蛋白质组学的积极影响及器官特异性细胞群的复壮提供了新治疗可能性。这些发现拓展了当前对人类细胞中BPs作用机制及体内局部组织与人体全身效应（图8）的理解，提示BPs可能通过法尼基焦磷酸合酶（FPPS）依赖及新的独立机制在衰老相关疾病中发挥有益效应。
