《Antioxidants》：Disulfiram Alleviates Metabolic Dysfunction-Associated Steatohepatitis in Mice via Inhibiting Aurora Kinase A and Restoring Autophagy
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代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）是一种严重、进行性的肝脏疾病，缺乏有效治疗方法。双硫仑（Disulfiram，DSF）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于酒精依赖的药物，除其主要适应症外还具有多样的生物活性。本研究旨在评估DSF是否对MAS
代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）是一种严重、进行性的肝脏疾病，缺乏有效治疗方法。双硫仑（Disulfiram，DSF）是一种经美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于酒精依赖的药物，除其主要适应症外还具有多样的生物活性。本研究旨在评估DSF是否对MASH具有干预前景，并阐明其潜在的分子机制。研究人员在胆碱缺乏、L-氨基酸定义饮食诱导的小鼠MASH模型以及暴露于游离脂肪酸（FFAs）以触发脂毒性的肝细胞中评估了DSF的疗效。结合生物信息学方法进行了RNA-seq分析，以识别关键通路和枢纽基因。采用蛋白质印迹（Western blotting）和实时荧光定量PCR（qPCR）进行机制验证。计算预测提示DSF可能影响胰岛素抵抗、炎症、自噬相关标志物和脂质代谢。在FFAs处理的肝细胞中，DSF给药剂量依赖性地减少了脂质积累和脂毒性。一致地，在MASH小鼠中，DSF给药显著降低了升高的血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）（35%）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）（40%）水平以及绝对肝脏甘油三酯含量（从1降至0.5 μg/mg蛋白），并明显减轻了肝脏脂肪变性、炎症、纤维化和氧化应激。值得注意的是，RNA-seq分析显示DSF调节了自噬相关通路，并确定极光激酶A（Aurora kinase A，AURKA）为显著下调的枢纽基因。机制上，DSF抑制了AURKA的表达，进而导致自噬相关标志物的变化。这些自噬相关标志物的变化在功能上与脂毒性减轻相偶联。总之，DSF通过抑制AURKA来缓解MASH，从而解除AURKA介导的对自噬相关标志物的抑制，这与脂毒性减弱相关，并最终实现对疾病进展的广泛抑制。因此，DSF是一个有前景的干预MASH的肝保护候选药物。
**论文解读：双硫仑通过抑制AURKA恢复自噬缓解代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎的研究**
**研究背景与问题**
代谢功能障碍相关性脂肪性肝炎（MASH）是代谢功能障碍相关性脂肪性肝病（MASLD）的炎症性、进展性亚型，是全球最常见的慢性肝病，并正演变为严重的公共卫生危机。其疾病谱从单纯性肝脂肪变性（MASL）进展至MASH，以肝细胞损伤和炎症为特征，并可能进一步发展为肝纤维化、肝硬化乃至肝细胞癌（HCC）。全球约30%–40%的成年人受MASLD影响，其中3%–6%为MASH，在肥胖和2型糖尿病群体中患病率更高。尽管生活方式干预仍是管理基石，但患者长期依从性不佳。2024年3月，Rezdiffra（Resmetirom）经FDA加速批准成为首个用于伴纤维化（F2–F3）MASH的药物治疗，但其批准仍为条件性，需持续确证临床获益。因此，探索新的干预靶点和策略，尤其是基于现有药物进行药物再利用以加速临床转化，成为MASH研究的迫切需求。
自噬是溶酶体介导的细胞内降解与再循环系统，在维持肝细胞代谢稳态中发挥核心作用。大量证据表明，在肥胖、衰老等易感条件下，肝自噬功能普遍下降，促进MASL向MASH转化。靶向增强自噬在临床前模型中已被证实能有效减轻肝脂肪变性、炎症和损伤。极光激酶A（AURKA）是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，传统上因其在有丝分裂中的关键作用备受关注，但近年在非有丝分裂过程中，特别是调节炎症和自噬方面的作用日益凸显。然而，AURKA在MASH这一代谢性炎症疾病中对自噬的调控作用及机制尚不清楚。
双硫仑（DSF）是FDA批准用于治疗慢性酒精依赖的药物，安全性记录良好。近年来，药物再利用研究发现DSF及其活性代谢物具有远超原适应症的广谱生物活性，包括显著的抗肿瘤、抗病毒、抗寄生虫作用以及改善代谢性疾病的潜力，但其具体分子机制尚不明确。基于上述背景，研究人员提出假设：DSF可能缓解MASH的发病过程，并旨在阐明DSF是否对MASH具有可干预性及其阻断疾病进展的机制。
**研究内容与结论**
本研究在胆碱缺乏、L-氨基酸定义（CDAA）饮食诱导的小鼠MASH模型以及游离脂肪酸（FFAs）处理的肝细胞中评估了DSF的疗效。研究发现，DSF给药剂量依赖性地减少了FFAs处理的肝细胞中脂质积累和脂毒性，在MASH小鼠中显著降低了血清ALT、AST水平及肝脏甘油三酯含量，并减轻了肝脂肪变性、炎症、纤维化和氧化应激。RNA-seq分析揭示DSF调节了自噬相关通路，并确定AURKA为显著下调的枢纽基因。机制上，DSF抑制AURKA表达，进而改变自噬相关标志物（增加LC3B-II、Parkin、TIM23、TOMM40，减少P62），这些变化与脂毒性减轻功能偶联。进一步通过AURKA激动剂实验证实，激活AURKA可逆转DSF对肝细胞脂质沉积的缓解作用及对自噬标志物的影响，表明抑制AURKA是DSF发挥肝保护作用的必要机制。
该研究首次提出并验证了利用FDA批准药物DSF用于MASH干预的新策略，揭示了AURKA–自噬轴作为代谢性疾病中新的干预节点，拓展了AURKA的非经典功能，为复杂代谢紊乱中的药物再利用提供了概念框架。论文发表在《Antioxidants》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术方法：（1）动物模型：使用8周龄雄性C57BL/6N小鼠，通过CDAA饮食构建MASH模型，腹腔注射DSF（25 mg/kg），每周三次，持续四周。（2）细胞模型：使用AML12小鼠肝细胞，以棕榈酸和油酸（PO）模拟脂肪毒性环境。（3）转录组学分析：对肝脏组织进行RNA-seq，通过比对筛选差异表达基因（DEGs），并结合GO和KEGG通路富集分析及基因集富集分析（GSEA）。（4）分子生物学验证：采用蛋白质印迹（Western blot）和实时荧光定量PCR（qRT-PCR）检测蛋白及mRNA表达水平。（5）组织学与生化检测：包括H&E、Oil Red O、Sirius-red染色及免疫组化（IHC）评估脂肪变性、纤维化和免疫细胞浸润；检测血清ALT/AST及肝脏甘油三酯、总胆固醇水平。（6）药理干预：使用AURKA激动剂（anacardic acid）进行体外功能验证。样本来源为小鼠肝脏组织及AML12细胞系。
**研究结果**
**3.1 DSF功能的计算预测**
通过PharmMapper预测DSF的290个潜在靶蛋白，并进行GO和KEGG富集分析，发现富集于非酒精性脂肪肝病、自噬、炎症负调控、脂质储存负调控、脂质转运调节等通路，提示DSF可能延缓MASH进展。
**3.2 DSF减轻代谢应激下肝细胞的脂质积累**
在PO处理的AML12细胞中，DSF（25、50、100 μM）剂量依赖性地降低Bodipy荧光强度（代表脂滴含量），减少细胞甘油三酯和总胆固醇水平，并下调脂质代谢基因SREBP-1c和APOB的mRNA表达。
**3.3 DSF缓解小鼠MASH模型中的疾病进展**
在CDAA饮食诱导的MASH小鼠中，DSF干预显著降低肝脏重量、肝重比、血清ALT/AST水平及肝脏TG/TC含量，并逆转肝脏大体外观（肝肿大、黄色变）和组织学脂肪变性（H&E染色）。
**3.4 RNA-seq生物信息学分析**
PCA分析显示组间转录组分离；DEGs分析发现DSF在CDAA组引起131个上调、217个下调基因。重叠DEGs富集于脂质代谢、细胞外基质组织及纤维化通路。GSEA结果证实DSF减轻肝脏脂肪积累、纤维化和炎症。
**3.5 DSF减轻MASH小鼠的肝脂肪变性、纤维化和炎症**
Oil Red O染色显示DSF减少脂滴面积；Sirius-red染色显示DSF减轻纤维化；qRT-PCR显示DSF下调脂肪生成基因（SREBP1c、ACCα、FASN）和促纤维化基因（LOX、TGF-β），上调脂肪酸氧化基因CPT-1A。IHC显示DSF抑制F4/80?和CD86?巨噬细胞及MPO?中性粒细胞浸润，增加CD163?巨噬细胞，并下调炎症因子TNF-α、CCL2、CXCL2的mRNA水平。
**3.6 DSF通过抑制AURKA恢复自噬减轻MASH中的肝细胞损伤**
GSEA显示DSF显著富集自噬相关通路。整合DEGs、靶点预测和自噬数据库，确定AURKA为下调枢纽基因。TUNEL染色和MDA检测显示DSF减轻肝细胞凋亡和氧化应激。Western blot发现DSF降低AURKA蛋白表达，同时增加LC3B-II、Parkin、TIM23、TOMM40水平，降低P62水平。体外实验同样验证DSF下调AURKA mRNA和蛋白表达。
**3.7 AURKA激活消除DSF对脂毒性和自噬的作用**
使用AURKA激动剂（60 μM）处理PO诱导的肝细胞，发现AURKA激活剂显著逆转DSF对脂滴积累的减轻作用（Bodipy荧光增强），并恢复自噬底物P62积累，降低TIM23和TOMM40水平，表明AURKA抑制是DSF缓解肝细胞脂毒性所必需的。
**讨论与结论**
讨论部分指出，本研究首次提出并验证了将酒精依赖药物DSF再利用于MASH干预的新策略，DSF在体内外均有较改善MASH核心病理表型（脂毒性、纤维化、炎症、氧化应激）。由于DSF已在临床使用数十年，安全性良好，有利于快速临床转化。但需注意，MASH患者常存在肝功能受损，DSF相关的罕见肝毒性风险需在MASH模型中进一步评估安全性。机制上，研究将DSF疗效与AURKA–自噬调节轴联系起来：DSF通过下调AURKA，解除其对自噬相关标志物的抑制，促进脂滴和受损线粒体清除，减轻脂毒性和氧化应激。本研究首次提供了AURKA激动剂的直接药理证据，证明抑制AURKA是DSF发挥肝保护作用的必要机制。
研究结论翻译如下：总之，本研究表明，DSF通过抑制AURKA表达并改变自噬相关标志物，缓解了CDAA饮食诱导的MASH相关肝损伤和脂毒性。更重要的是，研究将AURKA–自噬轴确定为代谢性疾病中的新型干预节点，丰富了AURKA的非经典功能，并为复杂代谢失调中药物再利用提供了概念框架。DSF是干预MASH的一个有前景的肝保护候选药物。
