《Cells》：Mesenchymal Stem Cells of Epicardial Adipose Tissue Show Differences in Immunophenotype and Osteogenic Potential in Patients with Coronary and Non-Coronary Heart Disease
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冠状动脉钙化（coronary artery calcification, CAC）是心脏病学中的一个紧迫问题。源自心外膜脂肪组织（epicardial adipose tissue, EAT）的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, M
冠状动脉钙化（coronary artery calcification, CAC）是心脏病学中的一个紧迫问题。源自心外膜脂肪组织（epicardial adipose tissue, EAT）的间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）可能作为心血管系统中成骨细胞的来源。本研究旨在评估和比较来自冠状动脉疾病（coronary artery disease, CAD）患者和主动脉瓣狭窄（aortic stenosis, AS）患者的EAT-MSCs的免疫表型、增殖和成骨潜能。根据关键标志物CD105、CD90、CD73、CD31、CD34、CD45和HLA-DR分析MSCs的免疫表型。通过群体倍增时间和培养物的特定生长速率评估细胞增殖。通过PCR检测RUNX2、SPP1、ALPL和BGLAP基因的表达水平，以及通过ELISA检测上清中的蛋白水平来评估成骨潜能。通过免疫荧光染色定性检测细胞中的成骨蛋白。使用光度法测量细胞外基质矿化强度。CAD患者EAT-MSCs中的CD73表达比AS患者EAT-MSC培养物低近50%。成骨诱导后，来自CAD患者的EAT-MSCs显示出成骨标志基因及其对应蛋白的表达增加。由CAD患者EAT-MSCs衍生的成骨细胞对细胞外基质的矿化强度高于对照组。具有冠状动脉钙化的CAD患者的EAT-MSCs在培养中显示CD73表达降低，且与无冠脉受累患者相比具有增强的成骨潜能。
**研究背景与问题**
冠状动脉疾病（coronary artery disease, CAD）是心血管系统最常见的病理类型，其严重并发症——冠状动脉钙化（coronary artery calcification, CAC）在70岁以上人群中发生率超过90%（男性）和67%（女性）。CAC导致血管弹性下降、血管运动反应异常、心肌灌注受损，进而恶化CAD预后并增加不良结局风险；同时，CAC使介入性冠脉血运重建手术复杂化，增加术中并发症和远期心血管事件风险。近年来，血管钙化被视为一种类似骨形成的主动细胞介导过程：动脉壁内细胞重编程为成骨样细胞，启动细胞外基质矿化。然而，关于心外膜脂肪组织（epicardial adipose tissue, EAT）中间充质干细胞（mesenchymal stem cells, MSCs）在此过程中的作用，目前文献关注不足。EAT是直接邻近心脏和冠脉的局部脂肪库，其体积与冠脉钙化程度独立相关，且有研究显示在冠脉钙化患者的EAT中骨形态发生蛋白2和骨桥蛋白基因高表达，提示EAT中的MSCs可能通过成骨分化参与CAC发病。本研究旨在通过比较CAD患者（伴冠脉钙化）与主动脉瓣狭窄（aortic stenosis, AS）患者（无冠脉钙化）的EAT-MSCs的免疫表型、增殖活性和成骨潜能，验证“EAT-MSCs成骨分化是CAC发病机制之一”的假说。论文发表在《Cells》。
**关键技术与方法**
研究人员从两个患者组（各30例）收集EAT样本：CAD组（确诊CAD，行冠脉旁路移植术，无主动脉瓣疾病，年龄<75岁）和AS组（确诊AS，行主动脉瓣置换术，冠脉造影无动脉粥样硬化病变，年龄<75岁）。主要技术包括：①流式细胞术（flow cytometry）分析MSCs表面标志物CD105、CD90、CD73、CD31、CD34、CD45、HLA-DR；②CCK-8试剂盒结合群体倍增时间和特定生长速率评估增殖；③β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）染色检测细胞衰老；④体外成骨诱导（使用商品化分化培养基）后，通过实时定量PCR（qPCR）检测成骨基因（RUNX2、SP7、BGLAP、ALPL、SPP1），ELISA检测对应蛋白（RUNX2、骨桥蛋白、骨钙素、碱性磷酸酶），免疫荧光染色确认蛋白定位，以及茜素红（Alizarin Red）染色结合光测法定量细胞外基质矿化强度。冠脉钙化程度通过心电图门控多层螺旋CT（MDCT）计算Agatston钙化评分。
**研究结果**
**3.1 免疫表型的比较评估**
在第3代，CAD患者EAT-MSC培养物中CD105阳性细胞比例显著高于AS患者（p=0.043），而CD73阳性细胞比例仅为50%，比AS组低1.5倍（p=0.0012）。CD90阳性比例无组间差异。两组细胞几乎不表达CD45、CD34、CD31或HLA-DR。
**3.2 增殖潜能的比较评估**
两组培养物中细胞数量从第1天至第10天逐渐增加，各时间点无差异。特定生长速率和群体倍增时间在两组间也无显著差异，表明EAT-MSCs的增殖能力不受患者疾病类型影响。
**3.3 细胞衰老的比较评估**
在第3代，两组培养物均存在少量β-半乳糖苷酶阳性衰老细胞，但CAD患者培养物中衰老细胞比例比AS组高25%。
**3.4 成骨潜能的比较评估**
成骨诱导后，CAD组EAT-MSCs中成骨标志基因和蛋白表达整体高于AS组：
- **RUNX2**：mRNA表达在第3和15天CAD组更高，第21天相当；蛋白水平第3天相当，第15天AS组更高，第21天CAD组显著超过AS组。
- **SPP1（骨桥蛋白）**：mRNA在第3和15天CAD组更高，第21天无差异；骨桥蛋白蛋白在整个分化期CAD组持续更高。
- **ALPL（组织非特异性碱性磷酸酶）**：mRNA仅在第15天CAD组更高；碱性磷酸酶蛋白在第15和21天CAD组显著更高。
- **BGLAP（骨钙素）**：mRNA在第3天CAD组比AS组高8倍（p=0.001），第15天两组相当，第21天仍CAD组更高；骨钙素蛋白在整个分化期CAD组显著更高。免疫荧光染色确认蛋白在细胞内的定位。
**3.5 细胞外基质矿化强度的比较评估**
CAD患者EAT-MSCs衍生的成骨细胞培养物中钙盐均匀分布，覆盖超过80%孔底面积，而AS组钙盐呈“结节状”不均匀分布。光测量显示CAD组矿化强度比AS组高17%~25%。此外，冠脉钙化评分（Agatston评分）与EAT-MSC培养物细胞外基质矿化强度显著正相关（p<0.001，r=0.68）。
**讨论与结论**
讨论部分指出，目前主流观点认为冠脉钙化源于血管平滑肌细胞（VSMCs）向成骨样细胞转分化，但MSCs作为未成熟细胞，其成骨分化效率高于终末分化的VSMCs，且EAT-MSCs紧邻冠脉，更易受局部炎症微环境（含IFN-α、TNF-α、IL-1、IL-6等促炎因子）影响而转向成骨表型。AS患者虽有瓣膜钙化，但其发病机制涉及机械应力而非冠脉粥样硬化，且该组患者吸烟和阳性家族史比例更低，可作为理想对照。本研究发现CAD患者EAT-MSCs中CD73表达降低，这可能与CD73催化AMP转化为腺苷的功能缺失有关：腺苷缺乏导致组织非特异性碱性磷酸酶（TNAP）活性升高，进而降解焦磷酸盐（主要内源性异位钙化抑制剂），从而解除矿化抑制。CD73低表达并未影响细胞增殖，但与增强的成骨潜能一致。成骨基因（如RUNX2、SPP1、ALPL、BGLAP）及其蛋白的表达模式表明，CAD患者EAT-MSCs在成骨诱导后更早、更强烈地进入成骨程序，最终形成更多矿化基质。相关性分析进一步支持EAT-MSCs直接参与CAC形成。
**结论翻译**
因此，CAD患者心血管危险因素和已存在的冠脉损伤的组合可能促使EAT-MSCs在这些病理条件下发生“重编程”，表现为体外成骨分化的承诺性。CAC程度与EAT-MSCs的细胞外基质矿化强度之间的相关性表明，这些细胞参与心脏血管钙化的发病机制。
