《Cells》：Serotonin Signaling and Vascular Reactivity in Cardiometabolic Disease and Cardiac Surgery
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阿尔茨海默病(AD)是一种多方面的进行性神经退行性疾病，以记忆缺陷和认知障碍为特征。该疾病通过β-淀粉样蛋白(Aβ)、过度磷酸化tau蛋白和神经变性的存在进行临床诊断。动物模型是理解AD发病机制和评估潜在治疗方法不可或缺的工具。然而，尽管已开发出超过200种啮
阿尔茨海默病(AD)是一种多方面的进行性神经退行性疾病，以记忆缺陷和认知障碍为特征。该疾病通过β-淀粉样蛋白(Aβ)、过度磷酸化tau蛋白和神经变性的存在进行临床诊断。动物模型是理解AD发病机制和评估潜在治疗方法不可或缺的工具。然而，尽管已开发出超过200种啮齿动物模型，但物种特异性差异限制了转化相关性。由诱导多能干细胞(iPSCs)生成的脑类器官有潜力弥合转基因小鼠模型与人类临床试验之间的差距。在此，研究人员描述了一种稳健的基于刺激的神经免疫类器官模型，该模型表现出具有AD相关病理标志的神经炎症、神经变性和脂质失调。使用包含神经元、星形胶质细胞、小胶质细胞和血管细胞的平面类器官，研究人员通过上清液蛋白质组学分析、免疫荧光染色、NfL和GFAP释放、单细胞RNA测序(scRNAseq)、批量RNA测序(bulk RNAseq)以及急性(24小时)和慢性(7天)通路分析，对诱导的AD样表型进行了深入表征。此外，研究人员显示，诱导的神经炎症、脂质失调和神经变性可以通过小分子得到改善。这个明确的诱导模型系统为使用源自人iPSCs的复杂多细胞脑微环境进行药物发现和开发提供了机会。
**论文解读文章**
**研究背景**
阿尔茨海默病(AD)是一种复杂的进行性神经退行性疾病，其病理特征包括β-淀粉样蛋白(Aβ)沉积、tau蛋白过度磷酸化及神经变性。尽管临床已开发出抗Aβ抗体（如lecanemab和donanemab），但因其成本、可及性及不良反应风险，治疗应用受限。此外，遗传学研究已将AD风险从早发性家族性AD(EOFAD)相关突变（APP、PSEN1、PSEN2）扩展至大量与散发性晚发性AD(SLOAD)相关的基因，其中载脂蛋白E4(APOE4)被确认为最强的遗传风险因子。然而，现有AD疾病模型多基于EOFAD突变转基因小鼠（如5xFAD），仅代表约5%的AD患者，且物种差异（特别是小胶质细胞和星形胶质细胞的人类特异性）导致临床前研究到临床试验的高失败率（约99.6%）。脑类器官技术，尤其是包含多种细胞类型的神经免疫类器官，为模拟人类特有的细胞互作提供了新平台。但传统类器官存在大小不均、细胞类型分布不均、坏死核心及小胶质细胞整合困难等问题。为此，研究人员开发了一种平面神经免疫类器官模型，具备均匀分布的功能性小胶质细胞，便于可视化和营养/药物扩散。
**研究目的与结论**
本研究的核心目标是表征一种基于刺激的AD疾病模型，即在平面神经免疫类器官中联合使用重组ApoE4蛋白(rApoE4)和Aβ，以诱导AD样表型。研究结论证实，该模型能够在急性（24小时）和慢性（7天）暴露后，稳健地引发小胶质细胞活化、脂质积累、神经炎症和神经变性，并表现出AD相关的生物标志物变化（如Aβ42/40比值升高、p-tau181/t-tau比值增加）。值得注意的是，该模型的促炎效应不依赖于小胶质细胞的APOE3/3或APOE4/4基因型，因此可适应不同遗传背景。此外，概念验证药物筛选表明，p38 MAPK抑制剂SB203580能有效降低IL-8分泌、小胶质细胞脂质积累及NfL释放，显示出该模型在药物发现中的潜在价值。该成果发表于《Cells》。
**主要关键技术方法**
研究人员采用以下关键技术：1) 基于聚乙二醇(PEG)水凝胶的平面类器官生成技术，整合人诱导多能干细胞(iPSC)来源的神经前体细胞(NPCs，来自APOE3/3男性白人供体)、内皮细胞(ECs，APOE3/3)、间充质干细胞(MSCs，APOE3/3)及小胶质细胞(MG，分别来自APOE3/3和APOE4/4供体，均为白人，性别不详)。2) 疾病诱导方法：向培养基中添加重组ApoE蛋白（rApoE4或rApoE3，1 μg/mL）和Aβ（1-42肽，5 μM）。3) 多组学分析：单细胞RNA测序(scRNAseq)、批量RNA测序(bulk RNAseq)及上清液蛋白质组学（71-Plex细胞因子/趋化因子检测、Aβ和tau 4-Plex检测）。4) 表型分析：免疫荧光(IF)染色定量小胶质细胞脂质积累（LipidSpot）及神经元标志物（βⅢ-Tubulin），ELISA检测神经丝轻链(NfL)和胶质纤维酸性蛋白(GFAP)释放。
**研究结果**
**3.1 APOE3/3 vs. APOE4/4小胶质细胞**
通过构建APOE3/3类器官并分别整合APOE3/3或APOE4/4小胶质细胞，研究人员发现：暴露于rApoE4后，含有APOE4/4小胶质细胞的类器官分泌高水平的IL-8，并表现出小胶质细胞球形度增加；而含有APOE3/3小胶质细胞的类器官对rApoE3无类似反应。急性（24小时）暴露后，IL-8分泌显著升高；慢性（7天）暴露后，出现小胶质细胞脂质积累、球形度增加及神经元标志物TUJ1减少。scRNAseq分析显示，无论小胶质细胞为APOE3/3或APOE4/4，暴露于rApoE4后均呈现类似的促炎转录响应（CXCL8、IL1B、IL-6上调），且通路分析表明两者在免疫应答和脂质代谢相关通路上高度相似。特别地，含有APOE3/3小胶质细胞的类器官在暴露于rApoE4+Aβ后，NfL释放显著增加，而APOE4/4小胶质细胞类器官的NfL基线水平较高但诱导后无显著增加。GFAP释放也在APOE3/3小胶质细胞类器官中增加。此外，IL-8的分泌主要依赖小胶质细胞的存在，且rApoE4+Aβ诱导的小胶质细胞脂质积累与LPS/IFNγ刺激不同，后者未在模型中诱导脂质积累。
**3.2 基于rApoE4 AD的刺激模型**
在APOE3/3类器官中（使用APOE3/3小胶质细胞），急性与慢性rApoE4暴露均引发持久且强烈的促炎反应。批量RNAseq的PCA分析显示，rApoE4处理组与对照组明确分离，而单用Aβ未产生显著转录偏移。细胞因子多重分析发现，小胶质细胞持续分泌高水平趋化因子和细胞因子，且在额外添加LPS/IFNγ刺激后，促炎因子水平进一步加剧（致敏表型）。转录组分析显示，小胶质细胞、星形胶质细胞等功能相关基因在急性期上调并持续至7天，免疫相关通路显著激活，而神经元通路持续下调。此外，该模型显著上调了GWAS鉴定的AD风险基因表达，并在Aβ种子类器官中随时间增加了Aβ42/40比值及暴露24小时后的p-tau181/t-tau比值。药物干预实验发现，与LPS/IFNγ刺激模型不同，rApoE4 AD模型对p38 MAPK抑制剂SB203580反应显著：IL-8分泌减少>30%，NfL和GFAP释放降低，且小胶质细胞脂质积累减少>50%；而TLR4拮抗剂TAK-242效果微弱。
**讨论与结论**
讨论部分指出，该刺激模型通过rApoE4与Aβ协同作用，可能主要通过两种机制诱导AD样表型：1) rApoE4竞争性抑制内源性ApoE3功能导致脂质失调；2) rApoE4直接激活免疫反应。scRNAseq还揭示系统性的ATP和线粒体相关通路改变（线粒体基因下调），与AD早期线粒体功能障碍一致，但本研究未深入探索。该平面类器官模型的高通量兼容性（活细胞成像、原位免疫荧光）及多因素表型读数（细胞因子、NfL、GFAP、脂质积累）为AD药物筛选提供了独特平台。研究局限性包括仅使用单APOE3/3供体（男性白人）和单APOE4/4供体（女性白人），需在更多遗传背景下验证。
**研究结论**：总之，研究人员描述了一种稳健的基于刺激的AD模型，使用rApoE4蛋白与Aβ组合。该刺激在急性（24小时）和慢性（7天）暴露下诱导持续的小胶质细胞促炎激活、神经变性和小胶质细胞脂质积累。促炎性IL-8、小胶质细胞脂质积累、神经元损伤（NfL释放）和星形胶质细胞损伤（GFAP释放）已被评估为具有高临床相关性的潜在药理学读数。初步发现提示其他生物标志物如Aβ42/40比值、p-tau181/T-tau比值或评估线粒体功能的读数可进一步优化用于未来靶向筛选。研究人员得出结论，该rApoE4 AD神经免疫类器官模型表现出多种临床相关的AD样表型，允许快速诱导AD表型，并从收集的培养基和类器官IF染色中获得稳健的多细胞读数。此外，类器官的贴壁平面形态有利于化合物在类器官内的扩散及孔内IF染色，无需冷冻切片——这是球形类器官在大型药物筛选活动中的主要障碍。总体而言，该模型为使用复杂多细胞脑类器官进行治疗开发、基于刺激的疾病诱导（展现多种临床相关AD生物标志物）以及高度适应于高内涵筛选和药物发现的类器官形态提供了独特机会。
