转录组变化驱动TGF-β诱导的前囊下白内障中涉及的多个调控通路

《Cells》：Transcriptome Changes Driving Multiple Regulatory Pathways Involved in TGF-β-Induced Anterior Subcapsular Cataract

　　

转化生长因子-β（TGF-β）促进晶状体上皮-间充质转化（EMT）和纤维化，导致前囊下白内障（ASC）形成。在晶状体中过表达TGF-β1的转基因小鼠已被研究了三十多年，然而活性TGF-β1过表达对晶状体上皮转录组的影响尚不明确。研究人员通过检测这些独特晶状体上皮的基因表达景观来填补这一知识空白。对从两个独立品系（OVE853和OVE918）的三周龄TGF-β1过表达转基因小鼠以及野生型小鼠分离的晶状体上皮进行了高通量RNA测序（RNA-seq）。下游分析包括与晶状体数据集（如白内障手术模型）的比较，以及利用多种资源/工具（如基因本体论（GO）、CompBio和iSyTE）进行的探究。与野生型小鼠晶状体上皮相比，在两个转基因品系的晶状体中共同鉴定出384个差异表达基因（DEGs）。参与EMT、炎症反应、细胞外基质组织和机械感觉的候选基因表达上调，而参与脂质代谢、Wnt抑制、Bmp和Notch激活的候选基因表达下调。与小鼠白内障手术模型的时间转录组比较分析识别出重叠的病理通路，一些上调基因（例如内质网应激基因）与人类ASC数据一致。这项研究提供了对两个独立TGF-β1转基因ASC模型的首次全面转录组学表征，并鉴定了与TGF-β1过表达相关的新型候选下游基因和通路。所有数据均通过iSyTE以用户友好的方式提供。

**研究背景与问题**
前囊下白内障（ASC）由晶状体上皮细胞发生上皮-间充质转化（EMT）形成纤维化斑块导致，转化生长因子-β（TGF-β）是公认的驱动因子。尽管TGF-β1过表达转基因小鼠（OVE853和OVE918品系）已作为研究ASC的金标准模型被广泛使用三十余年，但活性TGF-β1过表达对晶状体上皮全转录组的影响仍属空白。研究人员开展此项研究旨在通过高通量RNA测序（RNA-seq）解析转基因小鼠晶状体上皮的基因表达图谱，揭示下游信号通路和候选基因，为理解人类ASC的分子机制提供基础。该论文发表在《Cells》。

**研究方法概述**
研究人员从三周龄的OVE853和OVE918两个独立TGF-β1过表达转基因品系（FVB/N背景）及同背景野生型（WT）小鼠中分离晶状体上皮（包含前囊下斑块）。OVE853组收集3个样本（每样本来自9只小鼠），OVE918组收集4个样本（每样本来自7只小鼠），WT组收集3个样本（每样本来自9只小鼠），立即于Trizol中混合并提取RNA。采用Illumina平台进行150 bp双端mRNA测序，经Cutadapt修剪、STAR比对至小鼠参考基因组（GRCm39）、featureCounts定量后，用edgeR进行差异表达分析（|log2倍变化|≥1.0，错误发现率FDR≤0.05，FPKM≥2.0）。随后利用基因本体论（GO）、MSigDB Hallmark基因集、CompBio平台进行通路和主题富集分析，并与已发表的小鼠白内障术后模型（PCS）及人类后囊膜混浊（PCO）囊袋模型的转录组数据进行比较。数据可视化基于iSyTE数据库新开发的网页门户。

**研究结果**
**3.1 RNA-seq分析**：对OVE853、OVE918和WT小鼠晶状体上皮进行RNA-seq，平均获得4090万条读段，比对率77.3%。主成分分析（PCA）和多维标度（MDS）显示样本按类型聚类。鉴定出OVE853 vs WT有517个DEGs（280个上调，237个下调），OVE918 vs WT有627个DEGs（286个上调，341个下调），两品系共有384个共同DEGs（200个共同上调，183个共同下调），且log2倍变化高度相关（r=0.97），证实了数据的稳健性。

**3.2 基因本体与通路分析**：对384个共同DEGs进行MSigDB Hallmark分析，富集到“上皮间充质转化”（Epithelial Mesenchymal Transition）等通路。对200个共同上调基因的GO分析富集到“细胞外基质”（Extracellular Matrix）、“炎症反应”（Inflammatory Response）、“对机械刺激的反应”（Response to Mechanical Stimulus）等；对183个共同下调基因的GO分析富集到“突触信号”（Synaptic Signaling）和“转运体活性”（Transporter Activity）等。

**3.3 EMT相关基因上调**：TGF-β1过表达导致多数EMT相关基因（如Cdh2、Col1a1、Fn1、Itga5等）在两种品系中均上调，而Cdh1（E-钙黏蛋白）下调。Acta2和S100A4仅在OVE918中上调。

**3.4 炎症反应基因上调**：包括Axl、Ccl2、Ccl7、Icam1、Lcn2、Timp1等9个炎症相关基因在两种品系中均上调。

**3.5 细胞外基质基因失调**：在共同上调DEGs中鉴定出19个ECM相关基因（如Col1a1、Fn1、Mmp2、Postn等），在共同下调DEGs中鉴定出17个ECM相关基因（如Col18a1、Lama3等），提示TGF-β1过表达引发复杂的ECM重塑。

**3.6 机械感觉、FGF信号和细胞黏附基因上调**：与“对机械刺激的反应”相关的基因（如Piezo2、Whrn、Tnc等）、“成纤维细胞生长因子”（FGF）信号相关基因（如Apln、Axl、Spry1等）及细胞黏附相关基因（如Dab2、Fn1、Icam1、Postn、Spp1等）均上调。

**3.7 突触信号和转运体活性基因下调**：TGF-β1过表达导致与突触信号（如Abat、Apoe、Penk等）和转运体活性（如Slc1a3、Slc6a6、Atp1a2等）相关的基因下调，这些基因在正常晶状体上皮中高表达。

**3.8 CompBio分析**：对上调基因的CompBio分析识别出“TGFβ信号、EMT、纤维化”、“TIMP相关ECM重塑”、“上皮细胞通讯”等主题；对下调基因识别出“Notch信号、BMP信号”、“Wnt信号抑制、Notch信号”、“脂质代谢”、“神经元离子稳态”等主题。

**3.9 与PCS模型及人类PCO模型的比较**：将384个共同DEGs与小鼠白内障术后模型（PCS）不同时间点的DEGs比较，重叠基因在6 h为45个，24-120 h为166-177个，超几何检验显示重叠显著（p<0.05），方向一致性达87-89%。GO分析在后期阶段富集到“细胞迁移正调控”、“ECM组织”、“细胞黏附”、“对机械刺激的反应”和“TGFβR信号通路”。与人类PCO囊袋模型比较，发现116个重叠DEGs（30.5%），其中70.9%方向一致。

**3.10 ASC相关内质网应激基因和新型候选基因**：在TGF-β1过表达数据中，ER应激基因（如Calr、Hspa5、Xbp1、Wfs1等）上调，与人类ASC数据一致。此外，鉴定出Bcl3、Cfi、Cpxm2、Gal、Gjb3、Osmr、Spp1等7个尚未与TGF-β1关联的新型候选基因，它们在正常晶状体上皮中低表达，在转基因模型中显著上调。

**3.11 iSyTE数据访问**：研究人员将转录组数据整合到iSyTE数据库的新网页门户，用户可查询单个基因在OVE853、OVE918和对照中的FPKM值、倍变化及log2倍变化。

**总结讨论与结论**
讨论部分指出，这是首次对两个独立TGF-β1转基因ASC模型进行全面的转录组学表征，鉴定出384个共同DEGs。结果确认了EMT和ECM重塑相关基因的上调，以及晶状体上皮特性基因（如Cdh1、Gja1）的下调。Bmp4、Bmp7及其下游靶标Id4、Msx1表达降低，与上皮特性丧失一致；Notch通路配体Jag1和Dll1呈现相反调控，下游Hes1、Hes5降低，提示Notch通路复杂失调。ER应激基因在转基因小鼠和人类ASC中均上调，表明TGF-β1可能通过激活ER应激通路参与ASC发病。与PCS模型的比较显示，TGF-β1过表达足以独立于物理损伤诱导部分炎症相关转录程序。机械感觉基因Piezo2在TGF-β1过表达和PCS后期均上调，提示TGF-β1参与机械刺激响应。脂质代谢相关基因（如Acsl3、Apoe、Scd1）下调，与既往脂质组学研究一致，支持TGF-β1破坏脂质稳态的假说。新型候选基因（如Bcl3、Osmr、Spp1）需进一步验证。局限性包括全上皮分析可能稀释斑块特异性信号，未来可采用激光捕获显微切割或单细胞RNA-seq。

**研究结论（翻译）**
总之，本研究首次详细分析了活性TGF-β1在晶状体上皮中过表达对转录组的影响。基于此数据，研究人员的模型表明，与内质网（ER）应激和脂质代谢相关的不同通路在响应活性TGF-β1过表达时表达失调（图10）。连同其他通路（如炎症反应及Bmp、Notch、Wnt信号通路）的失调，这很可能促进细胞外基质（ECM）重塑、机械感觉反应和上皮-间充质转化（EMT），最终导致前囊下白内障（ASC）。本研究与先前将ER应激和脂质代谢失调与人类ASC相关联的发现一致。本研究还揭示了TGF-β1过表达与白内障术后晶状体上皮反应所共有的基因和通路，并确定了几个与TGF-β1相关的候选基因，供未来在晶状体上皮细胞生物学中分析。综上所述，这些数据为前囊下白内障相关的转录组变化提供了新的分子见解。