长时间缺血诱导细胞应激、促进细胞外基质重塑并损害人松质骨移植物活性

《Cells》：Prolonged Ischemia Induces Cellular Stress, Stimulates Extracellular Matrix Remodeling and Compromises the Viability of Human Cancellous Bone Grafts

　　

骨折愈合失败仍然是创伤与骨科外科中的一项主要并发症。自体松质骨移植是治疗萎缩性骨不连（non-unions）的金标准。然而，在翻修手术过程中，移植物可能暴露于显著的术中缺血时段，这可能对其质量与功能产生不利影响。因此，研究人员分析了不同缺血时长（0、30、60 和 90 min）对骨移植物细胞应激、基因表达及活性的影响，以确定移植的关键缺血时间窗。研究人员从 24 例因骨愈合失败接受翻修手术的患者中获取移植物样本。分析方法包括 mRNA分析阵列（mRNA profiler arrays）、逆转录聚合酶链式反应（RT-PCR）及免疫组织化学。持续 60 min 或更长时间的缺血诱导了应激诱导基因的表达，如 JUN 和 DUSP1。这与移植物内早期细胞应激相关，表现为缺氧诱导因子（HIF）-1α阳性细胞的出现，以及在缺血早期时间点 p16 阳性衰老细胞数量增加。进一步分析显示，在 60 和 90 min 缺血时，凋亡性裂解型 caspase-3 阳性细胞数量显著增加，提示移植物活性受损。此外，RT-PCR 分析显示，细胞外基质（ECM）基因表达谱由促成骨型向促成软骨型转变。综上，松质骨移植中组织获取后若缺血时间达到 60 min 或以上，应尽量避免，以维持移植物活性。

该论文发表于《Cells》，聚焦于自体松质骨移植物在术中离体保存阶段所经历的缺血损伤问题。骨折延迟愈合与骨不连在创伤骨科和矫形外科中始终是临床难题，尽管骨再生的细胞与分子机制已获得持续认识，但仍有 2%–10% 的骨折最终发展为延迟愈合或骨不连。对萎缩性骨不连及较大骨缺损而言，自体松质骨移植因兼具成骨性、骨诱导性和骨传导性而仍为临床金标准。此类移植物不仅提供结构支撑，也可携带促成骨前体细胞，促进间充质干细胞（MSCs，间充质干细胞）的募集，并借助结缔组织基质为骨再生提供支架。然而，临床翻修手术中，从骨移植物取材到植入受区之间常存在不同程度的术中延迟，移植物在室温离体保存期间失去氧和营养供给，形成组织缺血。尽管既往研究曾尝试通过调整储存温度和保存液优化骨移植物存活，但理想的术中处理方案尚无共识。正是在这一背景下，研究人员试图界定人自体松质骨移植物在临床相关条件下可耐受的关键缺血阈值，并解析缺血对细胞应激、活性及基质分子谱的影响。

研究人员纳入 24 例因延迟愈合或骨不连接受翻修手术的患者，获取 1–2 cm³ 自体骨移植物样本，主要来源于髂嵴，少数来自长骨。取材过程约 10–15 min，随后样本置于室温无菌 Ringer’s 溶液中保存 0、30、60、90 min，其中 0 min 组被定义为取材后基线（post-harvest baseline，phb），因为该组在取材过程中已经历相关缺血。研究采用 RT² Profiler? PCR array 进行氧化应激与成骨相关通路筛查，以 RT-PCR 在个体供者水平验证候选基因，并通过免疫组织化学检测 HIF-1α、裂解型 caspase-3、Ki67 与 p16，分别评估缺氧/细胞应激、凋亡、增殖及衰老状态；此外，还基于健康供者无血小板血浆开展凝血实验，分析 cartilage oligomeric matrix protein（COMP，软骨寡聚基质蛋白）对凝血酶原时间（PT）和活化部分凝血活酶时间（aPTT）的影响。

研究结果首先显示患者总体年龄、体质指数（BMI）及性别构成具有一定异质性，但论文主体重点并不在临床分层，而在不同缺血时长下组织分子与细胞学改变的动态观察。

在“3.2. Profiler Arrays for Oxidative Stress and Osteogenesis”部分，研究人员通过 RT² profiler arrays 发现，自体骨移植物在取材后 30 min 即出现明显基因表达变化。聚类分析将差异基因归为 3 个主要表达模式群，基因集富集分析（GSEA）提示受调控基因主要涉及 integrin、转化生长因子-β（TGF-β）、Wnt、血管生成及细胞因子/趋化因子介导的炎症信号通路。30 min 时，integrin 信号及多种 ECM 相关基因如 COL1A1、COL1A2、COL2A1、COL10A1 和 FN1 已明显上调，而 TGF-β 与 Wnt 相关基因中度上调；与此同时，炎症相关基因表达随时间进一步增强，尤其是编码白细胞介素（IL）-8 转录相关的关键调节因子 CXCL8 上调更为突出。该结果说明，骨移植物在离体后极早期即已启动应激与基质反应程序。

在“3.3. Inflammation and Cellular Stress Within Cancellous Bone Grafts”部分，RT-PCR 对筛查结果进行了验证。研究人员证实，CXCL8 呈明显上调趋势，而 JUN 与 DUSP1 在 60 和 90 min 缺血时较 phb 与 30 min 早期时间点显著升高，其中 DUSP1 在 90 min 时升高最为显著。免疫组织化学进一步显示，HIF-1α 阳性细胞比例在 phb 与 30 min 早期时间点即已超过 50%，提示细胞应激和缺氧相关反应在移植物取出后即迅速发生。由此可见，延长缺血不仅伴随炎症/应激信号增强，也意味着骨移植物从取材开始即处于生物学脆弱状态。

在“3.4. Viability of Cancellous Bone Grafts”部分，研究人员进一步评估移植物活性。结果显示，与 phb 和 30 min 相比，60 和 90 min 晚期缺血时 Ki67 阳性增殖细胞表达降低；相反，裂解型 caspase-3 阳性凋亡细胞显著增加，表明细胞死亡增强。与此同时，p16 阳性衰老细胞在 60 和 90 min 时较早期时间点显著减少。论文在讨论中将这一现象解释为：早期存在一群对应激敏感的 p16 阳性细胞，而随着缺血持续，这部分细胞可能进一步转入凋亡状态并被清除。无论机制如何，结果层面可明确得出，缺血达到 60 min 后，移植物细胞活性已出现明显受损。

在“3.5. Gene Expression of ECM in Autologous Bone Grafts”部分，研究聚焦于 ECM 基因表达谱变化。结果表明，促成骨型胶原 COL1A1 随时间变化无显著差异，但促成骨型 COL1A2 在 60 和 90 min 缺血时显著下降。与之相对，促成软骨型胶原 COL2A1 和 COL10A1 在 60 与 90 min 时显著升高。此外，FN1、fibulin（FBLN）2 与 biglycan（BGN）mRNA 水平均在晚期缺血显著升高，而 FBLN1 表达则呈下降趋势。综合这些变化，研究人员认为 ECM 基因表达谱发生了由促成骨向促成软骨方向的转移，并伴有基质重塑和炎症相关分子的增强。这一结论具有重要意义，因为骨移植物的再生潜能不仅取决于细胞是否存活，也取决于其维持成骨微环境的能力。

在“3.6. Effects of COMP on Blood Coagulation”部分，研究人员补充分析了与凝血及血管生成相关的标志物。RT-PCR 结果显示，COL15A1 在 60 和 90 min 缺血时显著升高，COMP 呈升高趋势。进一步体外凝血实验表明，在健康供者无血小板血浆中加入重组人 rhCOMP 后，PT 显著延长，aPTT 亦表现出升高趋势。该结果提示，缺血相关的 COMP 增加可能影响血肿凝固过程，而血肿稳定性对于碎片化骨移植物在缺损区的固定具有重要作用。不过论文同时保持谨慎，仅指出其“可能”影响移植部位凝血与稳定，并未将其上升为已被完全证实的直接机制。

讨论部分围绕几个核心问题展开。首先，研究证实人松质骨移植物在离体保存后 60 min 或更长时间会出现显著的细胞应激增强、凋亡增加及活性下降，提示这一时间节点具有临床警示意义。其次，HIF-1α 在早期即广泛阳性，说明取材阶段约 10–15 min 的过程本身已经构成实质性缺血，因此论文提出的 60 min 阈值应理解为“取材完成后再额外储存 60 min 或以上”的风险界限。再次，JUN、DUSP1、CXCL8 的上调说明炎症、氧化应激与 MAPK 相关调控被激活；COL1A2 下降而 COL2A1、COL10A1 上升，则从分子层面显示成骨支持环境减弱、软骨样基质倾向增强。FN1、BGN、FBLN2 等基因变化进一步提示缺血过程中伴随炎症放大及纤维化/重塑相关程序。COL15A1 的升高则可能关联抗血管生成效应，不利于移植物血管化与整合。论文也指出若干局限，包括样本量有限，无法充分分层分析年龄、性别、BMI、合并症、用药及供区差异的影响；同时，部分分子变化不能完全归因于缺血，也可能掺杂取材机械应力及离体操作本身造成的反应。

研究结论部分可译为：综上所述，本研究表明，在骨移植物取材后持续至少 60 min 的长时间缺血会激活细胞应激反应、降低移植物活性，并诱导细胞外基质（ECM）基因表达谱由促成骨型向促成软骨型转变。此外，长时间缺血还可能损害移植部位的血管生成及血肿凝固。因此，涉及自体骨移植的翻修手术应当进行周密协调，以尽可能缩短缺血时间。优化手术流程与移植物处理程序，或有助于避免达到 60 min 或更长的缺血时段，从而维持骨移植物活性及其再生能力。未来研究还应进一步评估缺血对自体骨移植物促成骨能力的影响，并探索低温保存及专用保存液等潜在保护策略，以减轻缺血诱导的组织损伤。