富含白细胞的富血小板血浆（L-PRP）通过CCL1-CCR8信号和PKM2调节促进衰老成纤维细胞复苏和真皮重塑

《International Journal of Molecular Sciences》：Leukocyte-Rich Platelet-Rich Plasma (L-PRP) Promotes Rejuvenation of Senescent Fibroblasts and Dermal Remodeling via CCL1-CCR8 Signaling and PKM2 Modulation

　　

富血小板血浆（PRP）被广泛用于皮肤年轻化和组织再生；然而，其生物学效应因白细胞含量和分子组成而异。研究人员探究了富含白细胞的PRP（L-PRP）增强衰老皮肤中细胞外基质（ECM）再生的机制，重点关注CCL1-CCR8/丙酮酸激酶M2（PKM2）信号轴。首先，研究人员证明了L-PRP含有显著高于贫血小板血浆（PPP）的CCL1水平。在衰老的人真皮成纤维细胞中，L-PRP以与PKM2二聚体形成和核转位增强相关的方式增加了CCL1-CCR8相互作用。这种增强伴随着Janus激酶（JAK）/信号转导和转录激活因子3（STAT3）通路的激活以及STAT3依赖的抗凋亡蛋白（Bcl-2、Bcl-xL）和增殖标志物（Cyclin D1）的上调，导致成纤维细胞增殖增加。此外，L-PRP增加了PKM2四聚体水平，促进了PKM2-SMAD7结合，并减少了SMAD7介导的转化生长因子（TGF）-β信号抑制，从而增强了SMAD2/3激活。这些分子事件增强了衰老成纤维细胞中I型和III型胶原的合成。在衰老小鼠中，皮内L-PRP注射引发了成纤维细胞增殖、胶原纤维沉积和皮肤弹性的剂量依赖性增加。核PKM2二聚体/STAT3信号和PKM2四聚体/TGF-β信号在L-PRP组中都得到更强激活。研究结果将PKM2确定为连接免疫来源趋化因子与成纤维细胞复苏的核心代谢和信号整合器。该研究提供了关于L-PRP如何通过协调调节成纤维细胞存活、增殖和胶原合成来促进衰老皮肤中ECM再生的机制性见解。

皮肤老化是皮肤科领域关注的核心问题，其内在机制涉及真皮成纤维细胞功能衰退所导致的细胞外基质（ECM）流失，尤其是I型和III型胶原的减少。富血小板血浆（PRP）虽广泛用于皮肤年轻化，但临床效果因白细胞含量不同而存在显著异质性。富含白细胞的PRP（L-PRP）因含有单核细胞、淋巴细胞和中性粒细胞而呈现更高水平的炎症因子，可能通过趋化因子信号直接调控基质细胞功能。然而，L-PRP如何通过免疫-代谢耦合影响衰老成纤维细胞的命运尚不明确。本研究假设L-PRP中的高浓度CCL1可与衰老成纤维细胞表面的CCR8结合，触发丙酮酸激酶M2（PKM2）的构象变化，即二聚体形式促进核转位激活JAK/STAT3通路以增强细胞存活与增殖，而四聚体形式则通过干扰SMAD7介导的TGF-β信号负调控恢复胶原合成能力。论文发表在《International Journal of Molecular Sciences》。

研究人员为验证这一机制，采用了以下关键技术方法：从5名健康成人（20–65岁）外周血经GPS? III血小板浓缩系统分离L-PRP与贫血小板血浆（PPP）；利用H₂O₂诱导人真皮成纤维细胞（HDFs）衰老建立体外模型；选用16月龄C57BL/6雄性小鼠进行皮内注射（低剂量1:100稀释、高剂量1:10稀释）的体内实验。通过酶联免疫吸附试验（ELISA）检测CCL1及胶原水平，蛋白质免疫印迹（Western blot）分析信号通路蛋白，蓝色原生凝胶电泳（BN-PAGE）评估PKM2寡聚状态，组织学染色（Masson三色、Herovici、免疫组化）观察胶原纤维及增殖标志物（PCNA），非接触式皮肤分析仪测量皮肤弹性。

研究结果按以下四个小标题呈现：

**2.1 L-PRP Increases CCL1-CCR8 Binding, NuclearPKM2 Dimer Signaling, and Proliferation Markers in Senescent Fibroblasts**：通过ELISA证实L-PRP中CCL1水平显著高于PPP；在H₂O₂诱导的衰老HDFs中，L-PRP增强了CCL1-CCR8结合，Western blot显示PKM2总表达及二聚体丰度升高，JAK和STAT3磷酸化增强，抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-xL及增殖标志物Cyclin D1上调，CCK-8实验表明成纤维细胞增殖率增加。

**2.2 L-PRP Increases PKM2 Tetramer Formation and SMAD Signaling Associated with Collagen Synthesis in Senescent Fibroblasts**：BN-PAGE和Western blot显示L-PRP提高PKM2四聚体水平，增强PKM2-SMAD7结合，降低SMAD7-TGF-β结合，促进核pSMAD2/3水平升高，ELISA和Western blot证明I型和III型胶原蛋白合成增加。

**2.3 L-PRP Dose-Dependently Increases CCL1-CCR8 Binding, NuclearPKM2 Dimer Signaling, and Proliferation Markers in the Aged Skin**：在16月龄小鼠中，皮内注射高剂量L-PRP（1:10稀释）相比低剂量（1:100稀释）显著增加皮肤组织CCL1-CCR8结合、PKM2二聚体水平、JAK/STAT3磷酸化及Bcl-2、Bcl-xL、Cyclin D1表达；免疫组化显示PCNA阳性细胞数呈剂量依赖性增多。

**2.4 L-PRP Increases PKM2 Tetramer Formation, SMAD Activation, Collagen Deposition, and Tissue-Level Elasticity in Aged Skin**：L-PRP处理组皮肤中PKM2四聚体、PKM2-SMAD7结合及核pSMAD2/3水平呈剂量依赖性升高，SMAD7-TGF-β结合减少；免疫组化显示I型和III型胶原染色强度增强，Masson三色和Herovici染色揭示总胶原纤维密度、新合成及成熟胶原纤维均显著增加，皮肤弹性仪测量显示弹性提升。

讨论部分总结了L-PRP通过CCL1-CCR8信号启动PKM2二聚体核转位激活JAK/STAT3通路，促进衰老成纤维细胞存活与增殖；同时PKM2四聚体与SMAD7结合解除TGF-β信号抑制，增强SMAD2/3介导的胶原合成。该双机制模型将L-PRP定位为免疫再生干预手段，为超越传统生长因子中心的PRP配方优化提供了框架。研究结论翻译如下：L-PRP通过将趋化因子信号（CCL1-CCR8）与PKM2构象状态联系起来，从而通过JAK/STAT3促进成纤维细胞存活和增殖，同时通过PKM2四聚体/SMAD7/TGF-β信号放大ECM生成的TGF-β/SMAD信号，增强衰老皮肤中的ECM再生。这些发现为优化PRP配方提供了超越以血小板衍生生长因子为中心范式的机制框架。