《International Journal of Nanomedicine》：Differential Proteomic Landscape of Plasma Neuron-Derived Extracellular Vesicles in Parkinson’s Disease with and without RBD: A Pilot Investigation
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背景：帕金森病（PD）在临床上具有异质性，快速眼动睡眠行为障碍（RBD）的存在定义了一种独特且侵袭性强的亚型。迫切需要分子生物标志物来理解和识别这些亚型。神经元来源的细胞外囊泡（nEVs）为脑病理学提供了一个窗口。方法：在这项初步研究中，研究人员通过L1CAM
背景：帕金森病（PD）在临床上具有异质性，快速眼动睡眠行为障碍（RBD）的存在定义了一种独特且侵袭性强的亚型。迫切需要分子生物标志物来理解和识别这些亚型。神经元来源的细胞外囊泡（nEVs）为脑病理学提供了一个窗口。方法：在这项初步研究中，研究人员通过L1CAM免疫捕获从28名受试者（PD-RBD、PD-noRBD和对照组）中分离血浆nEVs。使用数据非依赖采集质谱（DIA-MS）进行蛋白质组学分析。结果：研究人员定量了1354种蛋白质。比较分析显示，PD-RBD和PD-noRBD之间有239种差异表达蛋白（DEPs）。PD-RBD患者表现出显著更高水平的α-突触核蛋白（SNCA），并在细胞外基质重塑（例如，NRGN、ELAV3）通路中显示显著富集。相比之下，PD-noRBD以脂质代谢失调（例如，APOE、CETP）和全身性炎症为特征。特定的DEPs与运动严重程度、自主神经功能障碍和脑铁沉积相关。结论：这项初步研究揭示了PD-RBD和PD-noRBD的血浆nEVs之间存在不同的蛋白质组学特征，表明涉及结构/细胞外基质重塑与全身代谢-炎症通路的不同的病理生理过程。这些发现为PD中亚型特异性分层提供了一组优先的候选nEV生物标志物，有待进一步的大规模临床和功能验证。
帕金森病（Parkinson’s disease, PD）是第二常见的神经退行性疾病，全球约1300万人受累，其临床异质性显著，尤其是快速眼动睡眠行为障碍（RBD）的存在定义了一种独特且侵袭性强的亚型。PD-RBD亚型常表现出更快的疾病进展、更广泛的认知衰退及不同的外周症状，而约54%的PD患者从未出现RBD（PD-noRBD）。当前，针对PD的治疗仍停留在症状缓解层面，缺乏早期诊断和临床分层的客观分子标志物。尽管已有多种体液生物标志物被提出，但大多基于经典假说，缺乏基于无偏、全面蛋白质组学景观的探索。神经元来源细胞外囊泡（nEVs）作为“液体活检”来源，可跨越血脑屏障携带疾病相关分子，为揭示脑病理提供窗口。然而，RBD亚型如何影响nEVs的蛋白质组学特征，仍是未解决的关键问题。因此，研究人员开展此项研究，旨在通过分析伴或不伴RBD的PD患者血浆nEVs的蛋白质组学图谱，揭示亚型特异性分子机制，并筛选候选生物标志物。
研究人员从福建医科大学附属省立医院招募了9例PD伴RBD（PD-RBD）患者、11例PD不伴RBD（PD-noRBD）患者及8例性别年龄匹配的健康对照（HC），共28名受试者。通过L1CAM免疫磁珠捕获分离血浆nEVs，利用数据非依赖采集质谱（DIA-MS）进行定量蛋白质组学分析，结合生物信息学方法（主成分分析、差异表达分析、过表达分析（ORA）、基因集富集分析（GSEA）、蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络分析）及临床参数（UPDRS-III评分、疾病持续时间、QSM脑铁沉积指标）的相关性分析，筛选差异表达蛋白（DEPs）及候选生物标志物组合。
**结果**
**细胞外囊泡表征**
通过Western blot、透射电镜（TEM）和纳米颗粒追踪分析（NTA）验证了L1CAM
+ EV的成功分离。NTA显示粒径分布峰值约103 nm，TEM确认典型囊泡形态，Western blot检测到CD9、CD81、HSP90和L1CAM（CD171）标志物，证实成功富集神经元来源EV。
**差异表达蛋白（DEPs）鉴定**
基于TimsTOF HT-DIA蛋白质组学分析，共鉴定1354种可靠蛋白。主成分分析（PCA）显示三组间明显分离。差异分析发现：PD-noRBD与PD-RBD之间有239个DEPs（141个上调，98个下调）；PD-noRBD与HC之间有363个DEPs（191个上调，172个下调）；PD-RBD与HC之间有196个DEPs（88个上调，108个下调）。亚细胞定位预测表明，鉴定蛋白主要分布于细胞外空间（47%）、细胞质（20%）和细胞核（8%）。
**通路富集分析（ORA）**
ORA分析显示，PD-noRBD与PD-RBD相比，显著富集于“血微粒”“含胶原细胞外基质”“体液免疫应答”等GO条目，以及“补体和凝血级联”“胆固醇代谢”（KEGG）和“补体级联”“血小板脱颗粒”“胰岛素样生长因子转运调节”（Reactome）。关键枢纽蛋白包括脂质代谢中的APOE、CETP、PON1，以及铁代谢中的TF、TFRC和免疫调节中的C3、IGHG4。PD-RBD则更突出ECM重塑通路。
**通路富集分析（GSEA）**
GSEA进一步证实PD-noRBD富集于脂质代谢（胆固醇代谢）和免疫-凝血过程（补体级联），而PD-RBD富集于核质/染色质相关过程（核质、核酸结合）及核糖体通路（真核翻译终止）。PD-noRBD中蛋白合成和RNA代谢过程显著下调，提示其与PD-RBD在翻译调控机制上存在深刻差异。
**蛋白-蛋白相互作用（PPI）分析**
PPI网络显示，PD-noRBD与PD-RBD间的差异蛋白主要由脂质代谢和炎症蛋白（CETP、APOF、APOE、CRP、SAA4）构成枢纽模块。PD与HC比较时，ECM和蛋白聚糖相关簇（XYLT2、BGN、VCAN、DCN）及补体成分（SERPING1）成为核心，提示ECM重塑和免疫激活是PD的共同特征。
**DEPs与QSM指标及临床特征的相关性**
相关性分析显示，PD-RBD中升高的蛋白（如COL3A1）与苍白球QSM（铁沉积）正相关，而PD-RBD升高的蛋白（如MMP7）呈负相关。纤维蛋白原链（FGG、FGB）与纹状体铁沉积正相关。临床特征方面，AAMDC和PLTP与UPDRS-III运动评分正相关，ELAVL3呈负相关；疾病持续时间与代谢、细胞骨架及ECM重塑蛋白（AAMDC、PLTP、IQGAP1）正相关。便秘症状与MMP7、ENSA等正相关，与COL3A1、TF负相关。
**区分PD亚型的候选生物标志物**
hallmark蛋白SNCA在PD-RBD血浆nEVs中显著高于PD-noRBD。通过多标志物子集选择算法，筛选出两类策略：一是联合两个标志物（如COL3A1+NRGN）区分三组，二是单一标志物（如CSE1L、VWF、LTBP2）在每组中具有显著差异表达水平，但需进一步验证。
**讨论与结论**
本研究揭示了PD-RBD与PD-noRBD亚型在血浆nEVs蛋白质组上的显著差异：PD-noRBD以脂质代谢紊乱和全身炎症为特征，PD-RBD以ECM重塑、局部神经退行和活跃的RNA翻译调控为特征，与“body-first”（体首）与“brain-first”（脑首）假说一致。研究人员还发现“COVID-19”通路在两组中均富集，可能与受试者均曾感染COVID-19有关，但需进一步验证。尽管样本量小、L1CAM特异性争议及横断面设计等局限性存在，本研究为PD亚型分层提供了候选nEV生物标志物池。
结论：总之，这项探索性研究绘制了PD亚型的血浆神经元来源EV图谱。数据表明，PD-noRBD亚型倾向于表现出脂质代谢和全身炎症的改变，而PD-RBD显示出与局部翻译调控、神经退行和ECM重塑相关的特征。这些不同的分子图谱也提供了一组候选生物标志物，可能有助于患者分层并帮助阐明PD的临床异质性。
