《International Journal of Nanomedicine》：Toward Safe and Effective Gene Therapy: Non-Viral Nanostructured Delivery Systems
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基因治疗（Gene Therapy）已成为治疗多种遗传性和获得性疾病的一种变革性策略。尽管其潜力巨大，但临床转化受到病毒载体局限性的阻碍，包括免疫原性、插入突变、有限的载荷能力和生产挑战。因此，非病毒基因递送系统作为更安全、更多样化的替代方案日益受到关注。这些
基因治疗（Gene Therapy）已成为治疗多种遗传性和获得性疾病的一种变革性策略。尽管其潜力巨大，但临床转化受到病毒载体局限性的阻碍，包括免疫原性、插入突变、有限的载荷能力和生产挑战。因此，非病毒基因递送系统作为更安全、更多样化的替代方案日益受到关注。这些平台，包括基于脂质的纳米颗粒（Lipid-based Nanoparticles, LNPs）、聚合物（Polymers）、树状大分子（Dendrimers）、无机纳米载体（Inorganic Nanocarriers）和混合系统（Hybrid Systems），提供可定制的理化性质、可扩展的制造以及降低的不良免疫反应风险。本综述系统阐述了非病毒载体的最新进展，重点关注影响细胞摄取、内体逃逸、核定位以及在各种疾病（尤其是癌症）中整体转染效率的关键参数。此外，研究人员评估了近期临床前和临床研究，强调了有前景的转化结果和治疗应用。通过比较不同的非病毒策略并讨论其机制基础，本综述强调了非病毒载体克服病毒递送固有局限性的潜力，并推动开发更安全、更具适应性且临床相关的下一代基因治疗方法。
引言部分介绍了基因治疗在治疗癌症、遗传性疾病和病毒感染中的潜力，指出病毒载体在临床转化中面临免疫原性、插入突变、载荷能力有限和生产挑战等局限性。非病毒载体因其安全性、高载荷能力和设计灵活性而成为有吸引力的替代方案，包括物理方法和合成载体（如聚合物和脂质基纳米结构）。尽管临床前结果令人鼓舞，但非病毒系统的临床转化依然面临挑战。本综述聚焦于非病毒基因递送系统在多种疾病（尤其是癌症）治疗中的最新进展，并突出体外、体内和临床试验，特别强调当前临床试验结果和限制其成功转化的挑战。
非病毒基因递送原理部分阐述了非病毒载体因缺乏病毒固有的高效细胞进入和胞内运输机制，需通过合理设计克服多重生物学屏障，包括细胞内化、内体逃逸和持续基因表达。非病毒系统可分为物理、化学和混合方法，其中化学系统（如阳离子脂质、聚合物和树状大分子）通过形成多聚复合物或脂质复合物促进细胞摄取。纳米颗粒（NP）系统（1-1000 nm）因其独特的理化性质，可保护核酸免受酶解，增强细胞摄取，并实现可控胞内释放。关键参数包括尺寸（1-200 nm）、zeta电位（适度正电荷提高转染效率，过高则引起细胞毒性）和多分散指数（PDI）（<0.3确保均匀性）。基于组成，NP可分为脂质基、聚合物基、无机、树状大分子、碳基和混合系统。脂质纳米颗粒（LNP）因其与生物膜结构相似而具有良好生物相容性，可封装亲水和疏水分子，但稳定性仍受挑战。聚合物基纳米颗粒（PNP）具有高载荷能力和可调性，但高浓度下可能存在细胞毒性和非特异性相互作用。无机纳米颗粒（如金纳米颗粒Au NP和氧化铁纳米颗粒IONP）具有大表面积和易合成等优势，但需关注毒性和聚集问题。为提高递送性能，非病毒载体常通过功能化修饰，如连接靶向配体、添加聚乙二醇（PEG）以延长循环时间、引入pH敏感基团促进内体逃逸。细胞内运输涉及内吞作用、内体逃逸和核定位，其中内体逃逸是非病毒递送的关键瓶颈，可通过质子海绵效应等机制实现。
非病毒基因递送纳米颗粒部分详细分类描述了各类NP。脂质纳米颗粒（LNP）是有效的核酸递送系统，含可电离或阳离子脂质，但存在短期表达和细胞毒性问题。脂质体是LNP的古老形式，由磷脂双层包裹水核构成，已用于基因递送（如Onpattro?）。胶束由两亲性分子自组装形成，可封装亲水和疏水核酸，促进细胞摄取和内体逃逸。固体脂质纳米颗粒（SLN）由固态脂质构成，稳定性好，可控制释放，并具跨越血脑屏障（BBB）潜力。纳米结构脂质载体（NLC）结合固态和液态脂质，载荷能力优于SLN，但面临核酸载荷不足、稳定性差和毒性问题，截至2023年尚无FDA批准的NLC基mRNA递送或疫苗。聚合物纳米颗粒（PNP）和聚合物胶束方面，天然聚合物（如壳聚糖、海藻酸盐、明胶、白蛋白、环糊精）具有生物相容性和可降解性，但存在批次间差异。合成聚合物（如聚乙烯亚胺PEI、聚β-氨基酯PBAE、聚乙二醇PEG、聚赖氨酸PLL、聚乳酸-羟基乙酸共聚物PLGA）提供精确的分子量和结构控制，PEI通过质子海绵效应促进内体逃逸，PBAE具pH响应性，PEG可延长循环时间。研究实例显示，PEG-PEI-叶酸复合物靶向递送siRNA，PLGA-PEG-PBAE核壳NP实现高基因包封效率。无机纳米颗粒包括金纳米颗粒（AuNP）（生物相容、化学稳定）、银纳米颗粒（AgNP）（抗菌特性）和氧化铁纳米颗粒（IONP）（用于诊断和治疗），通过阳离子涂层或基因/载体复合物实现基因装载。硅纳米颗粒（Silica NP）通过多孔硅壳提供保护，表面氨基化增强静电结合。树状大分子（Dendrimers）如聚酰胺胺（PAMAM）具有高度分支结构，可通过质子海绵效应促进内体逃逸，第二代PAMAM经精氨酸和组氨酸修饰可改善脑部基因递送。混合纳米颗粒（Hybrid NPs）结合有机和无机组分，如脂质-聚合物、无机-有机杂化，可协同提高稳定性、靶向性和控制释放。例子包括PLGA-PBAE混合体系增强抗原呈递细胞（APC）递送，脂质包被的PBAE/mRNA复合物实现树突细胞内基因转移，IONP-PEI复合物用于MRI成像和基因递送，磁介孔二氧化硅微泡用于超声成像和基因转染，脂质-聚合物纳米结构靶向骨髓间充质干细胞（MSC）的CD44受体。
治疗应用部分非病毒基因递送系统已广泛探索于癌症治疗、遗传性疾病、感染性疾病和疫苗接种、神经系统疾病、心血管和炎症性疾病。癌症治疗利用NP通过增强渗透滞留（EPR）效应优先积累于肿瘤组织，表面功能化提高选择性，可共递送化疗药物和核酸产生协同效应；也用于癌症免疫治疗，如递送编码肿瘤抗原的mRNA。遗传性疾病方面，非病毒载体递送功能基因或CRISPR/Cas9编辑工具，脂质和聚合物载体在囊性纤维化和肌营养不良临床前模型中显示部分功能恢复。感染性疾病和疫苗接种方面，LNP介导的mRNA疫苗（如COVID-19疫苗）取得临床成功，非病毒载体还可递送DNA疫苗、siRNA和反义寡核苷酸，靶向淋巴组织增强免疫应答。神经系统疾病方面，NP通过尺寸优化和配体修饰跨越BBB，用于帕金森病和多发性硬化症。心血管和炎症性疾病中，非病毒递送旨在促进血管生成和组织修复，或调节细胞因子和信号通路。
临床试验部分非病毒纳米结构在临床中作为病毒载体的替代方案被研究。LNP已成为CRISPR/Cas9基因编辑的有效递送系统，用于治疗遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性伴多发性神经病（ATTRv-PN），首个临床试验NTLA-2001通过静脉输注靶向TTR基因，显示TTR蛋白水平显著降低。另一项临床试验（NCT01621867）使用阳离子脂质体递送编码囊性纤维化跨膜传导调节因子（CFTR）基因的pDNA，通过雾化给药治疗囊性纤维化，结果显示肺功能轻度改善且耐受性良好。基于mRNA的癌症疫苗Autogene Cevumeran（RO7198457）联合atezolizumab的临床试验（NCT03480152）针对局部晚期或转移性肿瘤，利用LNP递送患者特异性新抗原mRNA，成功诱导新抗原特异性T细胞应答。
未来方向部分指出基因治疗效率高度依赖于载体的安全性和特异性。病毒载体（如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒AAV）存在免疫原性、插入突变、载荷容量有限（AAV约4.7 kb）和生产挑战，推动了对非病毒载体的兴趣。未来研究需深入理解NP-细胞相互作用机制，包括细胞附着、内吞、胞内运输和基因表达途径。解决非特异性生物分布问题，开发配体功能化纳米载体或局部递送技术。设计多功能和刺激响应性纳米结构，如pH、氧化还原或酶响应释放。除NP外，偶联系统（如N-乙酰半乳糖胺GalNAc、胆固醇、肽、抗体、适体）也显示出潜力，GalNAc偶联已成功用于肝靶向siRNA递送。整合偶联技术与NP系统可能进一步提高靶向效率和稳定性。利用先进体外模型（如组织工程构建体、类器官）和计算模拟、AI预测模型可加速临床前评估。最终目标是设计无毒、不引发免疫反应、可生物降解、高载荷、延长循环时间并能穿透BBB的纳米载体。
结论部分总结非病毒基因递送系统相比病毒载体具有更安全、更多样化的优势，包括降低免疫原性、更大载荷容量和可扩展合成。尽管在载体设计上取得进展，但低转染效率、差的内体逃逸和有限的体内靶向性等挑战仍然存在。未来应着力于设计刺激响应性、可生物降解的载体，增强靶向性和胞内递送能力。整合基因编辑工具（如CRISPR/Cas）、开发诊疗一体化平台、结合疾病特异性配体有望改善治疗结果。推进体内验证、标准化评估方法并解决转化障碍，对实现非病毒基因递送的全面临床潜力至关重要。
