羽扇豆碱作为来自盐生假木贼（Anabasis salsa (C.A. Mey.) Benth. ex Volkens）的乙酰胆碱酯酶抑制剂——通过离心分配色谱法分离

《Molecules》：Lupinine as an Acetylcholinesterase Inhibitor from Anabasis salsa (C.A. Mey.) Benth. ex Volkens—Isolation by Centrifugal Partition Chromatography

　　

本研究调查了盐生假木贼（Anabasis salsa (C.A. Mey.) Benth. ex Volkens）（藜科）的植物化学组成和乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性，特别关注其提取物中存在的次生代谢物。研究人员使用HPLC-ESI-QTOF-MS/MS对植物提取物进行了分析，揭示了包括有机酸、酚类化合物、黄酮类和生物碱在内的多样化组成。后者由安那他品（anabasine）和羽扇豆碱（lupinine）代表，它们被鉴定为显著存在的化合物。根据提取物类型和植物部位的不同，羽扇豆碱在提取物中的含量范围为0.0033%至6.35%，其最高浓度出现在植物地上部分的酸化浸渍物中。离心分配色谱（CPC）采用由MTBE:ACN:n-BuOH:H₂O（2:2:1:5, v/v/v/v）组成的溶剂系统运行，用于最有前景提取物的分馏，实现了使用双相溶剂系统的有效分离。对所得馏分进行了AChE抑制活性评估，发现最活跃的馏分含有羽扇豆碱，并通过CPC成功将其纯化分离。这些发现凸显了羽扇豆碱作为一种具有神经保护潜力的重要生物活性化合物，并证明了CPC作为一种从复杂植物基质中分离生物碱的高效且可规模化方法的适用性。

神经退行性疾病（如阿尔茨海默病）的病理机制涉及胆碱能功能障碍，乙酰胆碱酯酶（AChE）过度水解乙酰胆碱导致认知衰退。现有药物（如多奈哌齐、利斯的明）仅提供症状缓解且伴随副作用，因此亟需发现新型、安全、高效的AChE抑制剂。天然产物，尤其是植物来源的生物碱，因其结构多样性和生物活性成为重要候选来源。盐生假木贼（Anabasis salsa, 藜科）是哈萨克斯坦及中亚地区的盐生半灌木，在传统医学中用于治疗神经炎、肌肉萎缩和中枢神经系统疾病，但其化学成分和生物活性研究仍不充分。本研究旨在系统分析盐生假木贼提取物的化学组成，利用离心分配色谱（CPC）高效分离活性成分，并评估其AChE抑制潜力，以探索其神经保护应用价值。

研究人员通过HPLC-ESI-QTOF-MS/MS对植物地上和地下部分的不同提取物进行成分分析，鉴定出有机酸、酚酸、黄酮类和生物碱（安那他品和羽扇豆碱）等代谢物，并半定量测定羽扇豆碱含量。选择碱化后的90%乙醇提取物（羽扇豆碱含量最高，达6.35%）进行CPC分馏，优化双相溶剂系统（MTBE:ACN:n-BuOH:H₂O, 2:2:1:5, v/v/v/v），成功分离出富含羽扇豆碱的纯化馏分。通过荧光法AChE抑制活性测试，发现羽扇豆碱标准品和含羽扇豆碱的CPC馏分表现出较强抑制活性（47.90%和43.74%），优于小檗碱（41.91%）。结论表明，羽扇豆碱是盐生假木贼中主要的AChE抑制活性成分，具有神经保护潜力，且CPC是一种高效、可规模化分离复杂植物基质中生物碱的方法。该研究为开发新型天然AChE抑制剂提供了先导化合物，并验证了绿色分离技术的应用前景。论文发表在《Molecules》。

主要关键技术方法包括：1) **HPLC-ESI-QTOF-MS/MS**：用于提取物成分指纹图谱分析和代谢物定性鉴定，以及羽扇豆碱的半定量测定；2) **离心分配色谱（CPC）**：采用MTBE:ACN:n-BuOH:H₂O (2:2:1:5, v/v/v/v)双相溶剂系统，在1200 rpm转速、4 mL/min（洗脱模式）和6 mL/min（挤出模式）条件下对碱化后的90%乙醇提取物进行分馏，收集28个馏分；3) **荧光法AChE抑制活性测定**：使用4-甲基伞形酮乙酸酯（4-MUA）为底物，在365 nm波长下检测荧光强度，以氯化小檗碱为阳性对照。样本来源：盐生假木贼地上和地下部分于2023年8-9月采集自哈萨克斯坦卡拉干达地区Akzhal村附近开花期植株，经植物学鉴定，凭证标本保存于卡拉干达布克托夫大学生物地理学院标本馆。

**2.1. 提取物HPLC-ESI-QTOF-MS/MS分析及半定量组成分析**：通过HPLC-ESI-QTOF-MS/MS在正负离子模式下分析，初步鉴定出有机酸（柠檬酸、苹果酸等）、酚酸（原儿茶酸、咖啡酸、阿魏酸等）及其糖苷、黄酮类（木犀草素葡萄糖苷、槲皮素二鼠李糖苷、异鼠李素己糖苷）、鞣质衍生物（没食子酰葡萄糖）以及生物碱（安那他品和羽扇豆碱）。半定量分析显示，羽扇豆碱在所有提取物中均检出，但含量差异显著：碱化后的90%乙醇提取物（AS-90tP）中含量最高（6.3523%），而氯仿提取物中最低（0.0080%），表明碱化处理显著增强羽扇豆碱的提取效率。地上部分为羽扇豆碱的较好来源。

**2.2. 盐生假木贼提取物的CPC分馏**：CPC作为一种无固体支持物的液-液色谱技术，可避免不可逆吸附，减少样品损失，且溶剂系统灵活可调，适用于热敏感生物碱的分离。本研究基于分配系数（K值）优化双相溶剂系统，以MTBE:ACN:n-BuOH:H₂O (2:2:1:5)为最佳，其K值在0.5-2.0范围内，无需酸碱改性剂，简化后续处理。

**2.2.1. 双相溶剂组成的选择**：测试了6种溶剂系统，计算主要成分的K值。系统4（MTBE:ACN:n-BuOH:H₂O, 2:2:1:5）使关键化合物K值接近最适范围，实现平衡分配，且无需添加酸性或碱性改性剂，便于放大应用。

**2.2.2. 盐生假木贼提取物的CPC分馏结果**：在1200 rpm、洗脱流速4 mL/min、挤出流速6 mL/min条件下，对600 mg碱化后90%乙醇提取物进行CPC分离，共收集28个馏分。通过HPLC-MS分析，确定羽扇豆碱富集于馏分24中，成功实现纯化。

**2.3. 乙酰胆碱酯酶抑制活性**：对粗提物和CPC馏分进行荧光法AChE抑制活性测定，以氯化小檗碱为阳性对照。结果显示，CPC馏分4（17-18号）和馏分9（24号）活性最高，抑制率分别为47.91±3.53%和43.74±2.50%；羽扇豆碱标准品（AS-Lup）抑制率为47.90±3.70%，略高于小檗碱（41.91±1.25%）。成分分析表明，活性馏分中均含有羽扇豆碱，但粗提物中羽扇豆碱含量与活性无直接线性关系，提示可能与其他成分存在协同作用。此外，馏分4中检测到可能为安那他品型生物碱的碎片离子，其结构需进一步NMR确证。

讨论部分总结：羽扇豆碱作为亲脂性药效团，可通过其喹诺里西啶核心的高脂溶性跨越血脑屏障，作用于血清素受体和胆碱酯酶，直接靶向脑突触。既往研究显示，羽扇豆碱及其酯类衍生物具有抗疟、抗结核、抗真菌和神经活性，支持其作为神经保护先导化合物的潜力。本研究结果进一步证实羽扇豆碱是盐生假木贼AChE抑制活性的主要贡献者，但神经保护活性未直接评估，需后续研究。

**研究结论翻译**：本研究证明，盐生假木贼（Anabasis salsa）是富含生物活性代谢物的植物资源，包括生物碱、酚酸和黄酮类化合物。HPLC-ESI-QTOF-MS/MS的应用实现了提取物的全面分析，确认了关键生物碱（安那他品和羽扇豆碱）的存在。离心分配色谱（CPC）被证明是一种高效且具有选择性的复杂植物提取物分馏技术，优化的双相溶剂系统实现了有效分离，并在不使用固体固定相的情况下成功从纯化馏分中分离出羽扇豆碱。CPC馏分的生物学评估揭示了显著的乙酰胆碱酯酶（AChE）抑制活性，其中最活跃的馏分含有羽扇豆碱。在实验条件下，分离得到的化合物表现出略强于小檗碱的抑制活性，凸显其作为强效天然AChE抑制剂的相关性。这些发现表明，羽扇豆碱是盐生假木贼提取物中重要的生物活性成分，也是观察到的乙酰胆碱酯酶抑制活性的主要贡献者。鉴于乙酰胆碱酯酶抑制在神经退行性疾病症状治疗中的既定作用，羽扇豆碱可能成为神经活性药物进一步研究的有前景的先导化合物。然而，其神经保护活性在本研究中未直接评估，需进一步研究。此外，本研究证实CPC是一种从复杂植物基质中分离生物碱的强大且可规模化的方法，在效率、选择性和降低溶剂消耗方面具有优势。