《Cancers》：A Novel Bruton’s Tyrosine Kinase Inhibitor Suppresses Pancreatic Neuroendocrine Neoplasms Progression via ATF3-Induced Ferroptosis
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目的：目前胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms, pNENs)的治疗方案仍有限，未能显著改善总生存期，因此开发新型药物至关重要。布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(Bruton’s tyrosine kinase in
目的：目前胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms, pNENs)的治疗方案仍有限，未能显著改善总生存期，因此开发新型药物至关重要。布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(Bruton’s tyrosine kinase inhibitors, BTKis)在实体瘤中显示出治疗潜力，但经典BTKi伊布替尼(ibrutinib)对神经内分泌肿瘤疗效不佳。本研究合成了一种新型吡咯并嘧啶基BTKi QY21，旨在探讨其体内外对pNEN细胞增殖的抑制作用，并明确介导其抑制效应的核心信号通路。方法：采用CCK-8、EdU和集落形成实验评估QY21对pNENs的体外作用；利用转录组测序、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)、蛋白质印迹(Western blotting, WB)和流式细胞术探索机制；建立裸鼠异种移植瘤模型进行体内验证。结果：QY21显著抑制pNENs体外增殖；与对照组和伊布替尼组相比，QY21在体内表现出更强的肿瘤生长抑制作用，组织病理学分析显示QY21组Ki-67指数降低，未见明显器官毒性损伤。转录组测序确定激活转录因子3(activating transcription factor 3, ATF3)是QY21抗增殖效应的核心介质；ATF3在pNENs中低表达，而QY21显著上调ATF3表达。机制上，QY21通过升高ATF3水平诱导铁死亡(ferroptosis)，敲低ATF3或给予铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可显著削弱QY21的抗增殖能力，伴随活性氧(reactive oxygen species, ROS)和脂质过氧化积累减少。结论：本研究证明新型BTKi QY21通过触发ATF3(ATF3)-介导的铁死亡抑制pNENs增殖，为pNENs提供了潜在的临床前策略。
该研究针对胰腺神经内分泌肿瘤(pancreatic neuroendocrine neoplasms, pNENs)现有治疗手段难以显著改善总生存期且伊布替尼(ibrutinib)等经典布鲁顿酪氨酸激酶抑制剂(Bruton’s tyrosine kinase inhibitors, BTKis)疗效不佳的临床困境，指出开发高效低毒新型靶向药物的迫切性。研究人员合成了系列新型吡咯并嘧啶基BTKi，筛选出活性最强的QY21，从体内外实验证实其通过上调激活转录因子3(activating transcription factor 3, ATF3)诱导铁死亡(ferroptosis)抑制pNENs进展，揭示了ATF3介导的铁死亡通路作为pNENs潜在治疗靶点的价值，该论文发表于《Cancers》。
为开展研究，研究人员采用人胰腺nestin表达导管细胞系HPNE、人pNENs来源QGP-1细胞系（购自日本研究生物资源细胞库JCRB0183）及BON-1细胞系（复旦大学肿瘤医院提供）作为体外模型；构建稳定转染ATF3敲低与过表达细胞系；通过CCK-8、EdU、集落形成实验评估增殖；利用转录组测序、qRT-PCR、蛋白质印迹(WB)、流式细胞术检测分子表达与活性氧(ROS)、脂质过氧化水平；建立BALB/c裸鼠皮下异种移植瘤模型（接种BON-1细胞）进行体内药效与毒性评价，以伊布替尼为对照，结合免疫组化与免疫荧光分析组织学变化。
3.1. Synthesis of Novel Pyrrolopyrimidine-Based BTKis with Superior Anti-pNENs Activity than Ibrutinib：研究人员经虚拟库筛选设计合成22种吡咯并嘧啶基BTKi，CCK-8法测定半数抑制浓度(IC50)发现QY21在QGP-1（24.47 ± 5.61 μM）和BON-1（8.53 ± 3.83 μM）细胞中IC50最低；分子对接显示QY21可进入BTK活性口袋（结合能?9.57 kcal/mol，抑制常数Ki 0.097 μM），虽预测结合亲和力弱于伊布替尼，但其体外抗pNENs活性优于伊布替尼，故选QY21开展后续实验。
3.2. QY21 Inhibits the Proliferation of pNENs Both In Vitro and In Vivo：体外CCK-8、集落形成、EdU实验表明QY21呈剂量依赖性抑制BON-1和QGP-1细胞增殖；体内裸鼠移植瘤模型中QY21组肿瘤体积与重量显著小于对照组及伊布替尼组，免疫组化示QY21组Ki-67指数最低，且各组小鼠体重无显著下降，心肝肾肺未见明显病理损伤，证实QY21体内外抑瘤且无显著器官毒性。
3.3. QY21 Upregulates Atf3 to Suppress the Progression of Pancreatic Neuroendocrine Neoplasms：转录组测序示QY21处理组差异表达基因(differentially expressed genes, DEGs)富集于铁死亡通路，交集筛选获HMOX1、ATF3、AKR1C1三个候选基因；qRT-PCR与WB验证QY21显著上调ATF3 mRNA与蛋白表达；免疫荧光、WB及临床组织免疫组化均证实ATF3在pNENs细胞与组织中低表达，QY21可显著上调其表达，提示ATF3可能参与激活铁死亡。
3.4. QY21 Inhibits pNENs Proliferation by Facilitating Ferroptosis, and the Suppressive Effect Is Partially Reversed by Ferrostatin-1：WB显示QY21上调转铁蛋白受体1(CD71)、长链脂酰辅酶A合成酶4(acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL4)，下调谷胱甘肽过氧化物酶4(glutathione peroxidase 4, GPX4)、溶质载体家族7成员11(xCT)、硬脂酰辅酶A去饱和酶1(stearoyl-CoA desaturase 1, SCD1)；联合铁死亡抑制剂Ferrostatin-1可逆转QY21导致的细胞活力下降、集落与DNA合成抑制，并减轻QY21诱导的脂质过氧化与ROS积累，证实QY21通过诱导铁死亡抑瘤。
3.5. Overexpression of Atf3 Restrains the Growth of pNENs Cells and Promoted Ferroptosis：构建稳定ATF3过表达细胞系，CCK-8、集落形成、EdU实验证ATF3过表达显著抑制pNENs增殖与DNA合成；流式细胞术示ATF3过表达增加脂质过氧化与ROS积累，表明ATF3过表达本身可诱导铁死亡并抑制pNENs生长。
3.6. Inhibition of Atf3 Suppresses Ferroptosis and Partially Reverses the Antineoplastic Effect of QY21 in pNENs：构建稳定ATF3敲低细胞系，EdU、CCK-8、集落形成实验示ATF3敲低部分逆转QY21的抗增殖效应；流式细胞术证ATF3敲低减弱QY21诱导的脂质过氧化与ROS积累，WB示ATF3敲低削弱QY21对CD71、ACSL4的上调及对xCT、SCD1的下调；体内移植瘤实验亦证ATF3敲低减弱QY21的抑瘤与铁死亡诱导作用，明确QY21通过上调ATF3触发铁死亡发挥抗肿瘤效应。
讨论部分总结：研究人员指出BTK除血液病外于实体瘤中具潜力，伊布替尼在晚期神经内分泌肿瘤(NENs)II期试验失败，而QY21体内外抗pNENs活性优于伊布替尼且安全性良好，其预测结合亲和力弱于伊布替尼可能因静态刚性
