阿尔巴尼亚地表水中产ESBL大肠杆菌的多样性和抗菌素耐药性特征

《Pathogens》：Diversity and Antimicrobial Resistance Profiles of ESBL-Producing Escherichia coli in Surface Waters of Albania

　　

这项研究首次对阿尔巴尼亚地表水（以Shkumbini河为重点）中的产超广谱β-内酰胺酶大肠杆菌（ESBL-Ec）进行了全面的分子表征。水生生态系统中的抗菌素耐药性（AMR）对公众健康构成重大威胁，但阿尔巴尼亚的相关数据仍然稀缺。研究人员于2022年9月至2024年2月期间，在爱尔巴桑附近六个地点采集了30份水样。遵循WHO三循环协议，分离出52株ESBL-Ec菌株，并对其抗菌药物敏感性、生物膜形成能力、耐药基因型以及通过脉冲场凝胶电泳（PFGE）确定的克隆相关性进行了表征。ESBL-Ec在80%的分析样本中被检测到，94.2%的菌株被归类为多重耐药性（MDR）。观察到对氨苄西林（98.1%）和头孢噻肟（86.5%）的高耐药频率，而7.7%的菌株表现出与mcr-3基因相关的粘菌素耐药性。blaCTX-M-1基因型最为普遍（57.7%），近一半菌株携带多种ESBL基因。系统群A（46.2%）占主导，其次为高风险肠外谱系B2（23.1%）和D（11.5%）。PFGE揭示了高度的遗传异质性，51种不同的脉冲型表明污染来源多样，如未经处理的城市、农业和工业废弃物。此外，55.8%的菌株具有形成生物膜的能力。这些结果突显了Shkumbini河作为高耐药病原体储库的关键作用，并强调阿尔巴尼亚亟需开展综合环境监测并改善废水管理。

**论文解读：阿尔巴尼亚地表水中产ESBL大肠杆菌的多样性与抗菌素耐药性特征**

**研究背景与问题**
抗菌素耐药性（AMR）是21世纪全球公共卫生的重大威胁，尤其在革兰氏阴性菌中，产超广谱β-内酰胺酶（ESBL）的大肠杆菌（E. coli）导致第三代头孢菌素疗效下降。大肠杆菌作为人类和动物肠道共生菌及条件致病菌，是环境AMR监测的理想指示菌（WHO三循环协议推荐）。地表水作为抗生素耐药基因（ARGs）和耐药菌的积累与传播枢纽，其污染来源包括未经处理的市政、农业和工业废水。然而，阿尔巴尼亚等西巴尔干国家缺乏国家AMR监测计划，地表水中ESBL-Ec的流行率、耐药谱及遗传背景尚不明确。研究人员假设Shkumbini河是遗传多样的多重耐药（MDR）ESBL-Ec的储库，包括与肠外致病谱系相关的系统群，旨在建立该国的环境AMR基线数据。

**研究内容与结论**
研究人员于2022年9月至2024年2月从Shkumbini河六个采样点采集30份水样，分离出52株ESBL-Ec。通过表型耐药谱、生物膜形成能力、ESBL基因型、系统群分型及PFGE遗传相关性分析，发现：ESBL-Ec在80%样本中检出，94.2%为MDR；耐碳青霉烯类（美罗培南9.6%、亚胺培南1.9%）和粘菌素（7.7%，携带mcr-3）的菌株尤为值得警惕；blaCTX-M-1基因型占主导（57.7%），系统群A（46.2%）最多，但高风险谱系B2和D合计占34.6%；PFGE显示51种独特脉冲型，遗传高度异质，提示多个污染源。该研究首次系统表征阿尔巴尼亚地表水中ESBL-Ec，证实Shkumbini河是MDR及耐最后防线抗生素菌株的重要环境储库，强调需整合环境监测和改善废水处理。论文发表在《Pathogens》。

**主要关键技术方法**
研究人员采用WHO三循环协议中的膜过滤法分离ESBL-Ec（水样100 mL，0.45 μm滤膜，TBX琼脂含4 μg/mL头孢噻肟）。抗菌药物敏感性通过纸片扩散法（15种药物）和微量肉汤稀释法（粘菌素）评估，依据EUCAST和CLSI标准判定MDR（≥3类耐药）。生物膜形成能力采用半定量微量板法（结晶紫染色，OD570 nm测量）。ESBL基因型通过多重PCR检测7个β-内酰胺酶基因家族（blaCTX-M-1/2/9/8/25组、blaOXA-1-like、blaSHV、blaTEM），粘菌素耐药菌株检测mcr-1至mcr-5。系统群分型采用Clermont多重PCR（arpA、chuA、yjaA、TspE4.C2）。克隆相关性通过PFGE（XbaI酶切，PulseNet标准协议）分析，使用Dice系数和UPGMA聚类。样本来源：Shkumbini河爱尔巴桑段6个采样点，2022年9月至2024年2月共30份水样。

**研究结果**

**3.1 ESBL-Ec的流行率**
从Shkumbini河30份水样中分离出52株ESBL-Ec，80%（24/30）的样本呈阳性，覆盖所有采样点。

**3.2 ESBL-Ec的表型特征——抗菌药物耐药谱与生物膜形成能力**
52株ESBL-Ec均对至少3种抗菌药物耐药，产生42种不同耐药谱（ARPs）。高耐药率见于青霉素（氨苄西林98.1%）、氨基糖苷类（链霉素98.1%）、头孢菌素（头孢噻肟86.5%、头孢他啶55.8%）、单环β-内酰胺类（氨曲南80.8%）。94.2%（49/52）为MDR。生物膜形成试验显示：48.1%为弱生产者，44.2%无产生能力，7.7%为中等生产者，与系统群无显著关联（χ2=13.050, p=0.367）。

**3.3 ESBL基因型与系统群的分布**
75%（39/52）的菌株检出至少一种ESBL基因，其中43.6%携带多种基因。blaCTX-M-1组最常见（57.7%），其次为blaTEM（30.8%）、blaOXA-1-like（11.5%）和blaCTX-M-9（11.5%）。4株粘菌素耐药菌均携带mcr-3。系统群分布：A（46.2%）、B2（23.1%）、D（11.5%）、B1（9.6%）、C（5.8%）、E（3.8%）。

**3.4 ESBL-Ec菌株的遗传相关性**
51株成功进行PFGE分型，产生51种不同脉冲型，在相似度≥57%水平上84.3%聚为13个簇（CL1-CL13），包含不同采样点菌株，但未见相同脉冲型，表明遗传高度异质且污染来源多样。

**讨论与结论**
讨论部分指出，Shkumbini河ESBL-Ec高流行率（80%）与阿尔巴尼亚高抗生素消费量（尤其是头孢菌素和喹诺酮类使用增加22-37%）及多地污染源（城市、农业、工业废水）相关。碳青霉烯和粘菌素耐药的出现（携带mcr-3）进一步缩小治疗选择，提示医院和畜牧废弃物的贡献。PFGE高度异质性印证了多源输入。系统群B2和D（肠外致病性谱系）占比34.6%，结合生物膜形成能力（55.8%），增加了菌株在水环境中的持久性和传播风险。采样点5成为高风险特征汇集点（高MDR、B2/D谱系、mcr-3集中出现），与爱尔巴桑附近点源污染压力相关。

**研究结论**
Shkumbini河是MDR和ESBL-Ec的重要环境储库。高流行率、多样的耐药基因谱和遗传异质性表明来自多个人为来源的持续污染。从公共卫生角度看，地表水中存在产ESBL、耐碳青霉烯和粘菌素的大肠杆菌，通过娱乐性用水、农作物灌溉和饮用水污染构成潜在人类暴露风险。这些发现强调了实施综合环境监测以跟踪水生生态系统中AMR的重要性。本研究受限于样本量较小，无法评估耐药模式与时空因素（如采样点、季节性）的潜在关联。未来需开展更大规模、纵向研究，并整合毒力因子（如粘附素、毒素、铁摄取系统）的分子表征或全基因组测序，以更准确评估环境ESBL-Ec对人类健康的意义。