水合和水解定义了大环内酯酯酶赋予的抗生素耐药性

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Hydration and hydrolysis define antibiotic resistance conferred by macrolide esterases

　　

大环内酯类抗生素是一类广泛用于人医和兽医的抗生素，其功能是通过干扰蛋白质合成来实现。遗憾的是，研究人员发现细菌中存在多种规避大环内酯类抗生素特性的策略，包括酶介导的灭活作用。这些机制现已广泛传播于致病菌、动物相关菌和环境细菌中，使其成为一个“一体化健康（One Health）”问题。大环内酯酯酶（macrolide esterases）通过水解大环内酯的内酯键，赋予了一种这样的耐药机制。迄今为止，已鉴定出两种类型的大环内酯酯酶：研究较深入的赤藓糖酯酶（erythromycin esterases）和最近发现的属于α/β-水解酶（α/β-hydrolase）超家族的Est型酶。研究人员对四种不同的Est型酯酶（EstTSf、EstTSt、EstTBc和EstXEc）进行了详细的结构-功能研究，它们之间仅共享44%至66%的序列同一性。除耐药谱分析和底物特异性研究外，研究人员还解析了所有四种酶的结构，包括水解后EstTBc和EstXEc与泰乐菌素（tylosin）和泰伐洛星（tylvalosin）大环内酯复合物的结构。结合突变和动力学研究的数据，研究人员得以详细分析大环内酯-酶相互作用的结构基础。综合来看，数据表明由水笼（water-cage）介导的混杂性结合和不精确的定位决定了Est型大环内酯耐药酶的底物特异性。这些见解可能对下一代抗生素的开发有所裨益。

**论文解读：水合作用与水解作用定义大环内酯酯酶介导的抗生素耐药性**

**一、研究背景、存在问题与研究意义**

大环内酯类抗生素自抗生素黄金时代以来，已在临床和农业中广泛使用，用于治疗革兰氏阳性菌及部分革兰氏阴性菌感染。然而，伴随其广泛使用，耐药性问题日益凸显。细菌通过多种机制逃避大环内酯类抗生素的作用，其中酶介导的修饰是重要途径之一。大环内酯酯酶（macrolide esterases）能够水解大环内酯内酯键，赋予细菌耐药性。已知的两类大环内酯耐药酶——赤藓糖酯酶（erythromycin esterases）和大环内酯磷酸转移酶（macrolide phosphotransferases）——已被较好研究，但近年来新发现的Est型酶（属于α/β-水解酶超家族，α/β-hydrolase superfamily）对16元环大环内酯类（如泰乐菌素、泰伐洛星）的水解活性及其结构基础尚不明确。已有研究表明，Est酶同源物广泛存在于多种病原和非病原细菌中，构成一个“一体化健康（One Health）”问题。然而，不同Est酶之间序列同一性较低（44%~66%），其底物特异性、催化机制及与耐药表型的关系亟待阐明。因此，本研究旨在通过系统结构-功能分析，揭示Est型大环内酯酯酶如何识别底物、催化水解并赋予耐药性，为开发更持久、不易被耐药酶降解的下一代大环内酯抗生素提供关键信息。论文发表在《Proceedings of the National Academy of Sciences》。

**二、主要关键技术方法**

研究人员采用了以下关键技术方法：1）**蛋白质生产与纯化**：将EstTSf（来源：*Sphingobacterium faecium*）、EstTSt（来源：*Sphingobacterium thalpophilum*，临床人伤口分离株）、EstTBc（来源：*Bacillus cereus*）和EstXEc（来源：*Escherichia coli*）四基因克隆入pET29b(+)载体，在*E. coli* Rosetta (DE3)或BL21(DE3)中表达并纯化。2）**定性生化评估**：使用高效液相色谱/质谱（HPLC/MS）检测酶对14、15、16元环大环内酯的水解活性。3）**最低抑菌浓度（MIC）测定**：评估基因在*E. coli*中表达后对系列大环内酯的耐药表型。4）**结晶与X射线衍射数据收集**：利用催化失活突变体（Scat→A）与泰乐菌素（TYL）或泰伐洛星（TYV）共结晶，同步辐射收集衍射数据。5）**结构测定与精修**：通过分子置换（PHENIX软件包，AlphaFold生成搜索模型）和迭代精修（COOT）解析晶体结构。6）**酶促动力学研究**：采用单次注射等温滴定量热法（ITC）测定稳态动力学参数；对慢速反应用HPLC/MS测定表观k_cat。7）**平衡结合研究**：利用色氨酸荧光猝灭法测量催化失活变体与大环内酯的解离常数K_d。8）**分子建模**：基于实验结构，用COOT和PyMOL构建所有四种酶与底物/非底物大环内酯的结合模型。

**三、研究结果**

**1. Screening for Macrolide Esterases（大环内酯酯酶的筛选）**

通过HPLC/MS分析重组酶对14、15、16元环大环内酯的水解能力（1 μM酶，200 μM底物，4 h），发现所有酶均不能水解14元环赤藓糖（ERY）和15元环托拉霉素（TUL），但能水解16元环抗生素。四种酶均能在4 h内完全水解200 μM泰乐菌素（TYL）和泰伐洛星（TYV）。仅EstTSf能在4 h内完全水解替米考星（TIP）；EstXEc对替米考星（TIL）的水解慢于另两种同源物。EstTSt和EstTBc活性更混杂，还可水解螺旋霉素（SPM）和交沙霉素（JOS）。在LB培养基中添加1 mM EDTA以增加通透性后，四基因均能赋予*E. coli*对TYL的耐药性，但只有*estTSf*能提供对半合成衍生物的强保护。结果定性反映了酶活性与耐药表型的一致性。

**2. Overall Structure for Macrolide Esterases（大环内酯酯酶的整体结构）**

研究人员解析了四种酶的五种晶体结构（分辨率范围1.65 ?~3.19 ?）。所有结构均证实属于α/β-水解酶超家族，具有典型的八链β-折叠核心和两侧的α-螺旋，以及一个由四个α-螺旋组成的固定帽状结构域。活性位点位于帽域与核心域界面，形成大“峡谷”状折叠。保守的催化三联体Ser-His-Asp位于中心，相邻有典型的氧阴离子空穴。不同酶在活性位点开口处存在差异：EstTBc的L11环无序；EstTSt中对应α-螺旋缺失，推测影响大环内酯结合。

**3. Macrolide Interactions with Est Active Sites（大环内酯与Est活性位点的相互作用）**

尽管结晶时都加入了TYL或TYV，仅在EstTBc和EstXEc结构中观察到明确的产物结合（线性化TYL或TYV，记为L-TYL和L-TYV），表明尽管使用了催化失活突变，水解仍发生了。三种复合物结构显示线性化大环内酯采用相似的结合模式：5-位置双糖朝向活性位点入口，14-位置单糖（β-1-麦辛糖基团）位于帽域下的封闭口袋。由此将底物结合位点划分为三个子口袋：5-口袋、内酯环口袋和14-口袋。在5-口袋中，末端麦卡罗糖（Mcr）在EstTBc和EstXEc中存在两种不同构象，可能与EstTBc的L11环无序有关。环口袋中，水解产生的羧酸基团靠近催化三联体和氧阴离子酰胺，羟基臂向外旋转（与底物结合状态相比，酯键假定位置发生位移）。值得注意的是，底物-酶间直接氢键很少（每个线性化大环内酯可形成超过20个潜在氢键，但仅观察到5~6个），而大量水介导的氢键（水笼）稳定了复合物。这暗示水笼使酶能捕获更多样化的底物，而非依赖直接特异性氢键。环口袋中主要相互作用为疏水性。

**4. Steady-State Kinetics Corroborate Expected AMR Phenotype（稳态动力学证实预期的耐药表型）**

对差异最大的两个同源物EstTSf和EstXEc进行稳态动力学分析：EstTSf对TYL的催化效率（k_cat/K_M = 3.4×10⁵ M^-1s^-1）比EstXEc（6.6×10⁴ M^-1s^-1）约高5倍；且EstXEc对TIL的表观k_cat仅约0.0005 s^-1。解离常数K_d测定显示，两种酶对TYL和TIL的亲和力相近（10~70 μM），且不管是否底物，酶与非底物大环内酯（如TIP）也有类似结合，表明水笼确实赋予混杂结合能力。基于结构比较，研究人员设计了四个EstXEc变体（E128G、W38Y/Q166L/N192E等），其中14-口袋的变体提高了对TYL的特异性（k_cat/K_M达3.4×10⁵ M^-1s^-1，与EstTSf相当），但E128G变体使TIL水解提高10倍，然而任何变体均未增加对TIL的耐药表型，表明催化决定因素并非简单可互换。

**5. In Silico Molecular Modeling of Macrolide Substrate Binding（大环内酯底物结合的计算机分子建模）**

基于实验结构，构建了所有四种酶与6种16元环大环内酯（TYL、TYV、TIL、TIP、SPM、JOS）的底物结合模型。结果显示，所有16元环大环内酯均可成功对接至活性位点而无空间冲突，即使其中一些并非有效底物（如EstTSf对SPM、JOS无活性）。这进一步说明结合并非催化的唯一决定因素。相反，14元环ERY和15元环TUL因3-位置有脱氧糖延伸，与活性位点产生严重空间位阻，无法建模，合理解释了为何这些抗生素不水解。

**四、讨论与结论**

**讨论总结**：自2023年发现α/β-水解酶家族大环内酯酯酶以来，这些酶已在多种环境菌、兽医病原菌及人类病原菌中被发现。本研究证明四种Est酶可水解16元环泰乐菌素系列大环内酯并在模型系统中赋予耐药性，其中两种酶（EstTSt和EstTBc）还能水解勒科霉素（leucomycin）系列，扩展了底物谱。Est酶的催化效率比早先报道的赤藓糖酯酶高1~2个数量级。结构分析表明，尽管序列同一性仅约50%，三维结构高度相似（r.m.s.d.约1 ?），与已知α/β-水解酶（如RdmC、Ade1等）有显著差异，尤其是帽域不同使得大环内酯无法结合到这些近源酶中，说明大环内酯酯酶是α/β-水解酶树上的一个古老独特分支。底物特异性的决定因素并非仅仅结合能力：动力学数据显示亲和力常数与底物是否被水解无关；分子建模也表明所有16元环均可绑定。研究认为，水笼介导的混杂结合导致底物定位不精确，从而限制催化效率——水笼既扩展又限制了底物范围。针对这一特点，通过修饰大环内酯骨架（如在3-位置添加大基团）可能同时干扰所有Est酶的绑定，同时又不影响核糖体结合，为开发新一代更难被水解的大环内酯提供了思路。

**翻译研究结论部分**：我们的结果表明，属于α/β-水解酶家族的的大环内酯酯酶是16元环大环内酯抗生素的混杂性结合者，并且该类别的成员能够赋予对天然和半合成药物的耐药性。鉴于Est酶多样性的不断扩大，几乎不可避免地会出现具有更广底物谱和更高催化活性的Est变体。这引起了对在兽医和人类环境中继续使用这些抗生素的深切担忧。此外，这些酶已经能够对半合成大环内酯变体提供耐药性，表明追求下一代大环内酯的开发可能颇具挑战性。具体而言，鉴于我们认为Est酯酶所具有的混杂结合特性，可能需要对16元环内酯骨架进行重大改变才能遏制这些酶的耐药特性。然而，产物状态的结构和底物结合状态的模型为哪些大环内酯药物开发途径更有前景提供了见解。六种不同大环内酯对四种不同酯酶的结合姿势的相似性表明，对骨架进行干扰与其中一种酶结合的改造很可能也会干扰与所有大环内酯酯酶的结合。例如，通过在3-或12-位置添加大体积基团来扩展骨架，可能会导致无法与任何Est酶结合的大环内酯变体。当然，基于所呈现的结果，可以设想下一代大环内酯开发的其他途径。