用于全面研究金属-植物铁载体复合物动态的新色谱与数据评估方法

《Analytica Chimica Acta》：NEW CHROMATOGRAPHIC AND DATA EVALUATION APPROACHES FOR THE COMPREHENSIVE INVESTIGATION OF METAL-PHYTOSIDEROPHORE-COMPLEX DYNAMICS

　　

Laura Zellner|Andreea Spiridon|Sangeeta Kumari|Simone Braeuer|Nicolas Kratena|Christian Stanetty|Eva Oburger|Tim Causon|Christian W. Klampfl|Stephan Hann

奥地利林茨约翰内斯·开普勒大学分析与普通化学研究所，地址：Altenberger Strasse 69，4040 林茨

摘要

背景

植铁载体是禾本科植物释放的根系分泌物，在微量营养素获取中起着关键作用。这一作用尤其体现在铁元素上，不过植铁载体也能与根际中的其他过渡金属形成复合物，从而影响这些金属的生物可利用性和吸收率。然而，要准确检测完整的金属-植铁载体复合物在分析上存在很大难度，目前的研究大多依赖针对少数几种特定植铁载体的方法。

研究结果

我们开发了一种液相色谱电喷雾离子化高分辨率质谱分析方法，通过混合模式固定相成功分离了2’-脱氧木吉酸、木吉酸以及3’-表羟基木吉酸，还有它们与Fe(III)、Cu(II)和Ni(II)形成的复合物。在温和的梯度条件下，这些复合物的结构得以保持完整，因此可以在负离子模式下对浓度在1到15 μmol L^-1范围内的复合物进行定量分析。

与此同时，我们还使用了MetalPicker这一新型软件工具，用于在液相色谱高分辨率质谱数据中非靶向地检测金属复合物。该工具利用过渡金属独特的同位素分布特征，能够以非靶向方式识别金属-植铁载体复合物。将MetalPicker与用于靶向定量分析的厂商软件进行对比验证，结果相当，这证明了MetalPicker在非靶向金属复合物分析中的准确性和实用性。我们在模型样本中应用该方法进行了竞争性络合实验，发现植铁载体对Cu(II)有很强的亲和力，这可能会限制植物对铁的吸收。

意义

我们的研究首次提出了一种既能分离金属-植铁载体复合物又能分离游离植铁载体的色谱方法，同时还结合了新型的非靶向金属复合物检测软件MetalPicker。这些技术的结合使得能够测定样品中共存的金属-植铁载体复合物，从而提升了研究根际金属动态和养分迁移能力的分析水平。

引言

铁既是植物生长所必需的微量元素，也是人类健康的重要元素，但由于其植物可利用性较低，全球范围内都存在微量营养素缺乏的问题。这种微量营养素不足现象与在pH值高、碳酸盐含量高的土壤上种植粮食作物密切相关，这类土壤会显著降低铁的溶解度和植物可利用性。在如此恶劣的土壤条件下，植物的铁吸收受到严重限制，进而导致作物产量和营养价值下降[1]。在覆盖全球约三分之一农业用地的碱性钙质土壤中，铁主要以难溶的氧化物和氢氧化物形式存在，此外，土壤中的通气作用还会使Fe(II)氧化为Fe(III)，进一步降低这种过渡金属的溶解度[2]。为了解决铁缺乏问题，禾本科植物会依靠一种螯合作用机制，即合成并分泌植铁载体。这些能够螯合金属的根系分泌物由禾本科植物释放，通过形成结构与氨基酸相似的稳定、可溶性的金属-植铁载体复合物，帮助在根际中转移微量营养素。这类金属-植铁载体复合物在高pH值的土壤中仍保持溶解状态，随后可通过膜转运蛋白被植物根部吸收，进而释放出铁元素[3]。

在禾本科植物中已发现的植铁载体中，木吉酸家族的几种类已被详细研究：木吉酸、2’-脱氧木吉酸、羟基木吉酸以及3’-表羟基木吉酸是禾本科植物中发现的四种典型的木吉酸类植铁载体[4]。这类植铁载体都会利用自身的三个羧酸功能团、两个氨基以及3’端的羟基，以六齿配位方式与Fe(III)结合形成复合物（见图S1）[5]。虽然植铁载体通常与铁元素的吸收相关，但它们也能与铜(II)、锌(II)等二价阳离子形成稳定的复合物（此时α-羟基处于质子化状态），越来越多的证据表明，植铁载体也有助于植物吸收铜(II)和锌(II)[6][7][8][9]。植铁载体可能与土壤中的多种二价或三价金属离子发生相互作用，这就意味着不同金属之间会在复合物形成过程中产生竞争关系[10][11]。近年来，3-羟基-2’-脱氧木吉酸和2’-羟基阿魏酸A也被确认为植铁载体，这使得已知的植铁载体种类有所增加；不过仍有大量能够螯合铁的分泌物尚未被识别[4]。由于配体种类和潜在的金属中心种类繁多，因此可能形成多种不同的金属-植铁载体物种，它们的形成和相互竞争会极大地影响土壤系统中金属的迁移、可利用性以及植铁载体和金属的整体命运[12][13]。

要了解这些相互作用，就需要具备能够可靠检测和区分多种金属-植铁载体复合物的分析技术。目前的分析研究大多只针对木吉酸家族中最常见的几种成员及其金属复合物，因为植铁载体无法从市场上购买，而且其化学合成过程既繁琐又成本高昂。因此，这类配体传统上都是从草本植物的根部或分泌物中分离出来的。这样一来，相关研究往往只聚焦于单一类型的植铁载体，且主要采用间接定量分析方法，比如铜迁移试验、铜铬偶氮蓝S试验以及铁结合试验，但这些方法的复合物回收率低、定量限高，线性度也较差[14]。为了推动对植铁载体的研究，人们已经为木吉酸、2’-脱氧木吉酸、3’-表羟基木吉酸、3-羟基-2’-脱氧木吉酸、阿魏酸A和2’-羟基阿魏酸A开发出了多种合成方法[15][16][17]。这些合成方法的出现使得更多直接的分析技术得以应用，而液相色谱结合电喷雾离子化质谱技术则成为了分析金属-植铁载体复合物的首选方法[11][18][19][20][21][22][23]。尽管金属-植铁载体复合物在土壤中非常稳定[10]，但在分析过程中的色谱分离或电喷雾离子化步骤中，这些非共价复合物仍有可能发生解离，这就给开发可靠的金属-植铁载体检测方法带来了很大困难。

另一个难题是要在色谱分离过程中同时实现弱酸性的游离植铁载体和带负电荷的金属-植铁载体复合物的分离。由于要保持复合物的稳定性，所需的pH范围很窄，因此这一分离任务十分艰巨。如果使用酸性洗脱剂来使游离植铁载体质子化，从而在反相色谱条件下提高其保留时间，那么又会破坏金属-植铁载体复合物的稳定性[18]。例如，我们团队之前的研究就发现，多孔石墨碳材料能够最佳地保留和分离游离植铁载体[24]，而金属-植铁载体复合物则可以在多模式反相蜡相固定相上被保留[11]。不过，虽然反相蜡相固定相能够保留金属-植铁载体复合物，但它对于分辨含有不同金属中心的复合物来说，选择性较低，色谱效率也不高。此外，在这些条件下也无法在一次色谱分析中同时保留游离植铁载体和金属-植铁载体复合物（这是我们团队未发表的初步实验结果）。因此，目前仍然缺乏一种能够有效解决这些问题的高效、简化的分析方法。

在这里，我们首次提出了一种色谱方法，该方法不仅能分离多种金属-植铁载体复合物，还能同时保留弱酸性的游离植铁载体。我们利用这种方法作为研究工具，通过竞争性实验来探究不同金属-植铁载体物种的行为，进而研究它们之间的亲和力差异。考虑到根际中存在的金属种类和金属螯合化合物种类极为丰富，我们还应用了一款新型的非靶向金属组学分析软件，该软件可以系统地在液相色谱高分辨率质谱数据中搜索与植铁载体相关的以及其他金属螯合化合物。

章节节选

化学品与材料

乙腈和冰醋酸（均为HPLC级）购自奥地利维也纳的VWR公司。25%氨溶液和二水合氯化钙（均用于分析目的）购自德国达姆施塔特的Merck公司。超纯水则来自美国马萨诸塞州贝德福德的Millipore公司的Milli-Q水净化系统。用于液相色谱的醋酸铵缓冲液是由50 mmol L^-1的醋酸溶液配制而成的，再使用25%氨溶液将其pH值调整至6.5，以此避免金属污染

在混合模式固定相上分离金属-植铁载体复合物与游离植铁载体

通过使用这种混合模式固定相，我们能够在一次色谱分析中分离出九种金属-植铁载体复合物以及对应的游离植铁载体配体（见图1）。这是首个能够在保持复合物稳定性的前提下，同时检测游离植铁载体及其金属复合物的色谱方法。

这种混合模式固定相结合了十八烷基配体以及一种季烷基胺形式的额外正电荷。

结论

在这项研究中，我们建立了一种新的液相色谱高分辨率质谱分析方法，该方法不仅能分离九种金属-植铁载体物种，还能保留游离植铁载体，从而让我们能够全面研究金属-植铁载体之间的相互作用以及竞争性络合行为。此外，我们还采用了新的MetalPicker工具，用于在非靶向分析中筛选液相色谱高分辨率质谱数据中的金属特征同位素模式。该工具有望检测出传统分析方法无法识别的金属复合物特征。不过，

CRediT作者贡献说明

Tim Causon： 文章撰写——审阅与编辑，研究指导。Christian W. Klampfl： 文章撰写——审阅与编辑，研究指导，资源提供。Stephan Hann： 文章撰写——审阅与编辑，研究指导，资源提供，项目管理，方法设计，概念构思。Laura Zellner： 文章撰写——审阅与编辑，初稿撰写，数据可视化，结果验证，方法设计，实验开展，正式分析。Andreea Spiridon： 文章撰写——审阅与编辑，方法设计。Sangeeta Kumari： 软件相关工作。Simone Braeuer： 文章撰写

利益冲突

作者声明，他们在本研究中所涉及的工作中没有任何利益冲突。

数据可用性

数据将应要求予以提供。

资金支持

本项目得到了BOKU核心设施——质谱分析实验室以及BOKU核心设施——生物信息学实验室的支持。我们还要感谢欧洲联盟在Interreg项目“代谢组学与药物化学基础设施”（项目编号ATCZ52）中提供的资金支持，这些资金用于在林茨的约翰内斯·开普勒大学购置IM-QTOF-MS质谱仪。Andreea Spiridon还获得了ERC的启动基金PhytoTrace（项目编号801954，项目负责人为Eva）的支持

利益冲突声明

? 作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知利益冲突或个人关系。