温和光热介导的神经免疫调节复合水凝胶逆转炎性破骨细胞前体表型以促进骨质疏松性骨缺损愈合

《Bioactive Materials》：A mild photothermal-mediated neuroimmunomodulatory composite hydrogel reverses the inflammatory osteoclast precursor phenotype to promote osteoporotic bone defect healing

　　

外周感觉神经系统在骨损伤修复中发挥着至关重要的作用。然而，氧化应激的过度积累与炎性微环境导致感觉神经再生不足或功能障碍，这与骨质疏松性骨缺损（OBD）的愈合受损密切相关。因此，特异性诱导感觉神经支配并增强其对骨微环境的调节功能已成为一种极具前景的治疗策略。在本研究中，研究人员开发了一种多功能复合水凝胶（MgAl-LDH@N/GP），其将负载神经生长因子（NGF）的MgAl-LDH纳米片整合到甲基丙烯酰胺明胶（GelMA）/聚多巴胺（PDA）系统中。该水凝胶有助于在骨缺损部位持续释放NGF，从而促进感觉神经生长。此外，它利用温和光热治疗（mPTT）激活瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV₁）阳离子通道，进而增强神经肽P物质（SP）的分泌。这种联合疗法显著降低了缺损部位炎性破骨细胞前体的比例，从而重塑局部免疫反应以促进骨愈合。体外和体内实验均表明，MgAl-LDH@N/GP水凝胶展现出优异的生物相容性。此外，它有效促进感觉神经生长，逆转iOCP表型，并驱动强健的血管生成-成骨耦合。通过这种神经-免疫调节，该系统显著加速了高质量的骨再生。

在全球人口老龄化的背景下，骨质疏松性骨缺损（OBD）的发病率逐年上升。由于其复杂的病理微环境、受损的骨再生能力和漫长的愈合周期，这已成为临床骨科面临的严峻挑战。传统的骨组织工程策略大多集中于诱导成骨分化或调节与骨再生相关的生物学过程。然而，骨作为一个高度集成的复杂器官，其生理稳态和损伤修复高度依赖于密集的神经血管网络。仅调节成骨分化无法完全重建神经和血管网络，难以实现有效的骨再生。尽管目前已开发出一些重建血管网络以促进骨修复的新策略，但神经网络在骨再生中的关键促进作用却常被忽视。研究表明，感觉神经网络在维持骨稳态中不可或缺，去神经骨折愈合研究证实感觉神经缺失会导致骨量减少并影响愈合。此外，感觉神经还能通过分泌多种神经营养物质正向调节血管网络重建并促进间充质干细胞的增殖与分化。因此，阐明感觉神经对骨微环境的调节作用及机制，干预“神经-骨”靶点，具有重要的科学意义与临床价值。

在众多神经调节策略中，温和光热治疗（mPTT）作为一种非侵入性物理疗法展现出巨大潜力。维持骨损伤局部温度约43°C不仅可上调热休克蛋白表达以加速细胞代谢，更重要的是，热刺激可作为特异性信号激活背根神经节（DRG）感觉神经元上的瞬时受体电位香草酸亚型1（TRPV₁，一种热敏离子通道）离子通道。TRPV₁激活后，感觉神经末梢可分泌降钙素基因相关肽（CGRP）、P物质（SP，一种神经肽）和信号素3A（Sema3A）等神经肽，作为“上游调节因子”启动骨再生级联反应。已知SP能改善线粒体功能、诱导巨噬细胞向M2表型极化并抑制炎症，但在OBD修复领域鲜有报道。此外，骨修复过程深刻依赖于骨骼与免疫系统的相互作用。骨损伤后，单核细胞来源的破骨细胞前体可在促炎刺激下表现为炎性表型（iOCP，可抑制感觉神经再生并阻碍神经-骨信号转导，且能融合为具有更强骨吸收能力的炎性破骨细胞）。因此，精准调节单核细胞谱系分化并逆转OCP的炎性表型是实现高质量骨再生的关键策略。

为解决OBD修复中神经支配不足和骨稳态失衡的双重挑战，研究人员构建了一种具有“热-化学”双重神经调节功能的注射型复合水凝胶系统（MgAl-LDH@N/GP）。该水凝胶可注射至骨缺损部位并原位交联，在近红外（NIR）照射下产生mPTT效应，激活感觉神经元表面的TRPV₁通道，促进SP释放，从而逆转iOCP表型并促进血管生成与成骨耦合。同时，水凝胶中嵌入的MgAl-LDH@CS-NGF纳米片作为智能“纳米储库”，实现NGF的长期缓释和生物活性金属离子的持续供应，协同改善受损的神经和骨微环境。该研究已发表于《Bioactive Materials》。

为开展此项研究，研究人员主要采用了以下关键技术方法：利用湿化学法合成MgAl-LDH纳米片并静电吸附负载NGF制备复合纳米片，随后将其引入甲基丙烯酰胺明胶与聚多巴胺体系中进行紫外光交联构建复合水凝胶；采用扫描电子显微镜（SEM）、原子力显微镜（AFM）及X射线光电子能谱（XPS）等进行材料表征；利用细胞计数试剂盒（CCK-8）和钙黄绿素染色评估细胞相容性；建立小鼠双侧去卵巢（OVX）骨质疏松模型及股骨远端缺损模型，结合近红外激光原位照射实施mPTT；运用琥珀酸脱氢酶染色、免疫荧光染色、定量实时聚合酶链反应（RT-qPCR）、转录组测序及微型计算机断层扫描评估体内外神经再生、表型逆转及成骨效应。样本队列来源于C57BL/6J小鼠及原代提取的骨髓间充质干细胞（BMSCs）、人脐静脉内皮细胞（HUVECs）和背根神经节细胞。

MgAl-LDH@CS-NGF的合成与功能评价
通过湿化学法及静电吸附作用，研究人员成功制备了呈规整六边形形貌的单层MgAl-LDH@CS-NGF纳米片。表征显示，在利用硫酸软骨素桥接荷正电的NGF后，纳米片的Zeta电位由正转负，且单层厚度约为1.5 nm，元素分布均匀，证实了复合纳米材料的成功构建且未破坏其结构完整性。

MgAl-LDH@N/GP水凝胶的制备与表征
将MgAl-LDH@CS-NGF引入GelMA/PDA体系构建了复合水凝胶。该水凝胶在405 nm紫外光下30秒内即可完成凝胶化，展现出良好的形态保持能力、适度的膨胀率及降解性能。在降解过程中，该系统可持续释放Mg²⁺并呈现温和的碱性趋势，营造有利于成骨分化的微环境。微观形貌显示其具有均匀且高度互联的三维多孔结构。在808 nm近红外激光照射下，该水凝胶在5分钟内迅速升温至约43°C，并在五个循环后仍保持稳定的光热性能，符合mPTT的最佳温度要求。

MgAl-LDH@N/GP水凝胶的细胞相容性
使用与成骨和血管生成密切相关的BMSCs和HUVECs评估了水凝胶的生物安全性。结果表明，所有水凝胶组细胞均保持良好活性，复合水凝胶联合mPTT处理能够显著促进细胞增殖，并诱导细胞骨架发育和重排，显著促进BMSCs和HUVECs的早期黏附与铺展，为加速血管化骨组织再生奠定基础。

体外评估mPTT促进DRGCs释放SP
利用Fluo-4 AM钙荧光探针验证了mPTT对TRPV₁通道的激活作用，结果显示复合水凝胶联合NIR照射显著增强了神经元的钙内流。免疫荧光、蛋白质印迹及酶联免疫吸附测定证实，近红外光热刺激有效触发了感觉神经元中SP的合成与分泌。在DRG外植体培养模型中，复合水凝胶联合mPTT显著促进了轴突的延伸，证实其能增强SP表达并强效促进DRG轴突生长。

SP经由ATF4-CHAC1通路逆转iOCP表型
通过干扰素-γ（IFN-γ）和核因子κB受体活化因子配体（RANKL）共刺激诱导产生iOCP，并利用不同水凝胶处理后的DRGCs条件培养基进行干预。研究发现，富含SP的条件培养基显著减少了抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）阳性细胞的数量与面积，并使iOCP向稳态型破骨细胞前体发生显著的形态转变。RT-qPCR证实下调了炎性标志物并上调了抗炎因子。RNA测序分析表明，SP治疗显著下调了阳离子转运调节因子样蛋白1（CHAC1）及其上游转录因子激活转录因子4（ATF4）的表达，从而减轻氧化应激并恢复细胞内氧化还原平衡，进而逆转iOCP表型。

体外评估SP介导逆转iOCP表型对成骨和血管生成的作用
通过收集不同处理条件下的OCPs条件培养基进行Transwell共培养等实验，发现SP介导逆转iOCP表型后，显著上调了BMSCs中RUNX2和骨桥蛋白（OPN）的表达，碱性磷酸酶（ALP）染色和茜素红S（ARS）染色证实其有效促进了早期成骨分化和晚期矿化结节形成。同时，HUVECs的划痕愈合与小管形成实验表明，该策略显著增强了内皮细胞的迁移与血管网络形成能力。

体内评估神经发生与SP介导逆转iOCP表型
在C57BL/6J小鼠中构建OVX诱导的骨质疏松性骨缺损模型。溶血及组织学评估证实该水凝胶系统具备优良的系统生物安全性及可控降解性。近红外照射后原位温度可维持在约43°C。体内免疫荧光染色表明，复合水凝胶联合mPTT显著增加了缺损区感觉神经的浸润及SP的表达，同时大幅降低了TRAP⁺ CX3CR1⁺ iOCPs的浸润，成功逆转了体内的炎性破骨细胞生成，为骨再生创造了有利的微环境。

MgAl-LDH@N/GP联合mPTT加速体内血管化骨再生
微型计算机断层扫描和三维重建显示，复合水凝胶联合mPTT组实现了几乎完整的缺损桥接及大量新生致密骨组织，其骨体积分数（BV/TV）、骨小梁数量及厚度等形态计量学参数均为最优。组织学与免疫荧光染色结果显示，该组缺损区成骨标志物（RUNX2和OCN）及血管标志物大量表达，显著促进了血管生成-成骨耦合。RT-qPCR分析同样证实了成骨相关基因的显著上调。

总结讨论部分，本研究设计的多功能复合水凝胶结合mPTT，不仅克服了传统生物材料仅提供物理支持或缺乏靶向神经干预的局限性，还实现了从被动释放到近红外触发的按需脉冲释放SP的范式转变。该系统通过mPTT介导的神经肽释放和NGF的持续递送，成功重塑了缺损区的炎性病理微环境，逆转了iOCPs表型，进而促进了强健的血管化骨再生。
研究结论：本研究设计了一种具有“热-化学”双重神经调节作用的多功能水凝胶（MgAl-LDH@N/GP）以促进OBD愈合。利用PDA的光热转换能力，该平台在NIR照射下实现了局部温和光热增强的感觉神经肽SP分泌，并逆转了iOCP表型以减少胞内异常活性氧积累。通过构建这一有利的微环境，该水凝胶联合mPTT显著促进了BMSCs的成骨分化与血管生成，推进了骨再生进程。这种多模态协同治疗策略凸显了该系统在协调神经-成骨相互作用及实现高质量骨再生方面的独特价值，从根本上避免了传统开放植骨手术带来的严重继发创伤与感染风险，为治疗临床挑战性的不规则较大骨缺损提供了新的策略。