一种多效性单分子缓释再生支架实现缺血性脑卒中后协同修复

《Bioactive Materials》：A pleiotropic single-molecule, sustained-release regenerative scaffold enables coordinated repair after ischemic stroke

　　

缺血性脑卒中诱导急性氧化损伤，继而导致长期炎症与组织重建不完全，亟需能够提供持续神经保护与修复支持的局部治疗策略。在此，研究人员开发了一种可注射杂化支架，其集成了脑顺应性水凝胶与短电纺纳米纤维，用于持续局部递送莫诺苷(MOR)——一种具有抗氧化、抗炎及促再生活性的多效性小分子。水凝胶提供早期MOR释放以减轻急性损伤，而纳米纤维在实现持续释药的同时提供仿细胞外基质(ECM)线索，支持血管生成、神经发生与轴突重塑。体外研究表明，在缺血条件下MOR增强内皮细胞与神经元存活，并促进其迁移与谱系特异性分化。在大鼠皮质脑卒中模型中，载MOR支架显著改善运动恢复、减小梗死体积、增强血管化、抑制胶质瘢痕并形成、促进轴突再生。转录组分析揭示广泛的微环境重编程，包括炎症通路抑制及PI3K-AKT相关修复信号富集，伴随p-PI3K与p-AKT免疫荧光增强。上述结果证实，将结构工程支架与小分子耦合可支持缺血性脑卒中后多种修复相关反应，并为修复缺血性脑损伤提供具转化潜力的策略。

研究背景方面，缺血性脑卒中作为脑卒中最为常见的亚型，仍是全球范围内致死与长期致残的主要病因之一，每年影响超过七百万人。尽管溶栓与机械取栓可在筛选患者中恢复灌注，但其治疗时间窗狭窄，且无法减轻继发性神经退行性变或补偿内源性修复不足，导致大多数患者功能恢复不完整。脑卒中后再生过程具有动态时序性：急性期以过度氧化应激、兴奋性毒性和广泛神经元死亡为主；亚急性期以神经炎症、胶质活化和迟发性凋亡为特征；随后病变微环境转向恢复，内源性神经干细胞与祖细胞启动神经发生、血管生成、轴突出芽及突触重塑，这对重建神经环路与恢复功能至关重要。现有可注射生物材料支架常通过在水凝胶中复合多种治疗药物（如小分子、生长因子、微球、纳米粒或胶束）来匹配组织演化需求，但多组分体系不可避免引入结构与组成复杂性，且生物制剂稳定性有限并具潜在免疫原性，给化学、生产与质量控制(CMC)及临床转化带来挑战。莫诺苷(MOR)作为山茱萸来源的环烯醚萜苷，具备跨越脑卒中后多阶段的多效药理活性：急性期抗氧化、上调超氧化物歧化酶与谷胱甘肽过氧化物酶、稳定血脑屏障紧密连接；亚急性期抑制小胶质细胞与星形胶质细胞活化及TNF-α、IL-1β、IL-6等促炎因子；再生期促进室下区与梗死周皮质神经干细胞增殖与神经元分化、增强突起延伸与突触发生及促血管生成。基于此，研究人员构建了水凝胶-纳米纤维复合支架以实现MOR的长期缓释，利用可注射水凝胶提供脑顺应性软基质与早期突释以应对急性氧化应激与炎症、维持血脑屏障完整；嵌入的可降解短电纺聚己内酯/Ⅰ型胶原(PCL/COL-I)纳米纤维提供仿ECM力学线索与持续局部释药以支持神经发生、轴突生长、血管生成与突触重建，从而在单一小分子框架下降低配方复杂度并整合结构支持与释药功能。

关键技术方法方面，研究人员采用体外氧糖剥夺(OGD)模型模拟缺血条件，以人脐静脉内皮细胞(HUVECs)与SH-SY5Y神经母细胞瘤细胞评估MOR的血管生成与神经保护效力；通过硫醇化透明质酸/肝素-明胶水凝胶与聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)交联体系，结合载MOR的短电纺PCL/COL-I纳米纤维制备杂化支架，利用高效液相色谱(HPLC)分析包封率(EE)、载药量(DLC)与释药动力学；通过扫描电镜(SEM)、流变学、溶胀与降解实验表征理化性质；以RAW264.7巨噬细胞评估免疫调节，Transwell评估神经元迁移；在体研究采用内皮素-1(ET-1)诱导的大鼠皮质缺血模型（Sprague-Dawley大鼠，经宣武医院伦理委员会批准XW-20231009-1），于伤后第3天行皮质内支架植入，通过梯棒行走测试与转棒测试评估运动功能，组织学采用H&E、Bielschowsky银染及NF200、MBP、CD31、GFAP免疫荧光分析，转录组采用RNA-seq与GO、KEGG富集及p-PI3K/p-AKT免疫荧光验证。

研究结果部分，2.1 The angiogenetic and neuroprotective efficacy of MOR中，研究人员通过OGD处理HUVECs划痕实验与CCK-8证实MOR在0.2–1.2 mM浓度依赖性地促进内皮细胞迁移与增殖，管形成实验显示其增强血管网络组装；对SH-SY5Y细胞，CCK-8与Tuj1免疫荧光表明MOR促进神经元分化与突起延长，1.2 mM效果最显著，证实MOR在缺血条件下具促血管生成与神经发生活性。2.2 Physicochemical properties of the hybrid scaffolds and release kinetics of MOR中，研究人员制备含1 mM MOR与3 mg/mL载MOR短PCL/COL-I纳米纤维（平均长度93.3±39.3 μm）的杂化支架，水凝胶EE为89.08±2.91%、DLC为3.61±0.12%，纳米纤维EE为44.17±5.92%、DLC为4.21±0.56%；SEM显示纳米纤维直径约445±21 nm，杂化支架孔径由约57 μm增至约96 μm；流变学显示存储模量G’为140–146 Pa，匹配天然脑组织；杂化支架降解1个月后保留39.3±11.1%质量，高于单纯水凝胶的25.5±3.3%；释药显示前7天初释约18.2%，4周累计释药157.1±23.7 μg，长于单纯水凝胶的113.8±9.1 μg，纳米纤维增强滞留与延迟释放。2.3 Modulation of inflammatory response, angiogenesis, and neuronal cell behavior中，研究人员以OGD处理的RAW264.7细胞发现载MOR支架下调M1标志物CD86、TNF-α，上调M2标志物CD206，促进抗炎极化；对HUVECs，载MOR支架较单纯支架进一步提升增殖与管形成（血管面积、节点数、管长增加）；对SH-SY5Y细胞，Transwell显示MOR促进趋化迁移，CCK-8与Live/Dead证实增殖与活力提升，10天分化后Tuj1染色显示突起长度在无RA时即显著延长，RA存在下达87.8±28.1 μm，高于对照43.9±14.3 μm与单纯支架45.3±16.2 μm，表明支架在缺血条件下促进神经元迁移、增殖与分化。2.4 Functional recovery and tissue remodeling in a stroke model中，研究人员在ET-1大鼠模型中选择1.2 mM MOR植入，梯棒测试显示第28天载MOR支架组错误率降至4.9±3.5%，对照约11.2±1.6%、单纯支架8.8±0.6%；转棒测试第28天跌落潜伏期达22.1±7.3 s，为对照1.9倍、单纯支架1.5倍；H&E显示梗死腔面积减少69.4±2.4%；Bielschowsky银染显示轴突密度为对照2.1倍、单纯支架1.2倍；NF200免疫荧光显示梗死核心NF200荧光强度为对照6.0倍、单纯支架1.3倍，NF200阳性细胞数为对照5.8倍、单纯支架1.3倍；MBP在梗死核心无显著差异但在周梗死区NF200与MBP荧光强度分别为对照1.9倍与1.5倍、单纯支架1.4倍与1.3倍；CD31显示梗死核心血管密度较对照增3.1倍于单纯支架之上，GFAP阳性细胞数较对照减少47.7%、较单纯支架减少33.6%，证实载MOR支架改善运动、减小梗死、促进血管与轴突再生并抑制胶质瘢痕。2.5 Transcriptomic insights into scaffold-mediated regeneration中，研究人员对第28天组织行RNA-seq，PCA显示对照与载MOR组分离，差异基因239个上调、1402个下调；GO富集关联细胞因子调控、伤口愈合与ECM组织；KEGG富集显示PI3K-AKT、NF-κB、Rap1、NOD样受体等通路；免疫荧光显示载MOR组梗死核心与周区p-PI3K/PI3K比值增1.2倍、p-AKT/AKT比值增1.6倍，提示PI3K-AKT相关修复信号可能参与但需进一步验证因果。2.6 Conclusion中，研究人员总结称开发了一种由短电纺PCL/COL-I纳米纤维嵌入脑仿生水凝胶、共载具再生潜力的稳定小分子MOR的可注射杂化支架，通过水凝胶与纤维分区实现持续释放；体外促进M2极化、内皮与神经元迁移及分化；大鼠模型中改善行为、减小梗死、增强轴突再生、再髓鞘化、血管化并抑制胶质瘢痕；转录组与免疫染色提示PI3K-AKT相关信号可能关联修复反应；该整合策略对缺血性脑损伤功能修复具临床转化平台意义，并可推广至中枢神经系统再生。

讨论总结与结论翻译部分，研究人员在讨论中指出，该单分子缓释再生支架通过水凝胶早期突释与纳米纤维持续释药的分级释放设计，匹配脑卒中后急性期至再生期的时序生物学需求，同时以仿ECM纳米纤维提供结构支持，避免了多组分生物制剂的不稳定性与免疫原性问题。体外与体内证据一致表明该平台协同调控免疫（M2极化）、血管（CD31+血管增生）与神经（NF200+轴突再生、Tuj1+神经元分化）多重响应，并通过转录组重编程抑制炎症、激活PI3K-AKT相关修复通路以改善微环境。结论部分原文翻译为：在本研究中，研究人员开发了一种多功能可注射杂化支架，由嵌入脑仿生水凝胶基质中的短电纺PCL/COL-I纳米纤维组成，共负载MOR——一种具临床相关再生潜力的药理稳定小分子。该平台旨在复制脑细胞外基质的结构与力学特征，同时通过在水凝胶与纤维区室中的差异整合实现MOR持续释放。体外研究表明，该支架促进M2巨噬细胞极化、增强缺血条件下内皮与神经元细胞迁移并支持神经元分化。在大鼠脑卒中模型中，载MOR支架显著改善行为学结局、减小梗死体积，并在抑制胶质瘢痕形成的同时增强轴突再生、再髓鞘化与血管化。转录组分析与免疫染色提示PI3K-AKT相关信号可能关联这些修复反应，尽管通路因果关系仍有待验证。综上，这些发现表明将结构工程支架与多效性小分子整合可对修复相关的免疫、血管与神经反应产生协同有益效应，该策略为促进缺血性脑损伤功能修复提供了具临床转化潜力的平台，并可作为中枢神经系统再生的通用平台。论文发表于《Bioactive Materials》。