在糖尿病小鼠中，GPR75基因敲低可通过AMPK通路缓解视网膜神经节细胞中的线粒体功能障碍

《Biochemical Pharmacology》：GPR75 knockdown alleviates mitochondrial dysfunction in retinal ganglion cells via AMPK pathway in diabetic mice

　　

刘梦仁|程雪|刘文强|于红丹|于胜学|王亚丽|陈新远|苗全玲|袁一荣|戴伟|胡佳伟|张娜|隋嘉恒|刘学政|左忠福

中国锦州医科大学解剖学、组织学与胚胎学系，锦州

摘要

线粒体功能障碍在视网膜神经节细胞损伤中起着关键作用，而这种损伤是糖尿病视网膜病变早期发病机制的重要部分。G蛋白偶联受体75是一种孤儿受体，被视为代谢疾病的新调控因子。然而，目前尚无关于GPR75在糖尿病视网膜神经节细胞线粒体功能障碍中的作用及机制的研究报道。为探究GPR75的功能，我们在链脲佐菌素处理的小鼠以及高糖处理的原代视网膜神经节细胞中敲低了该受体。研究显示，糖尿病视网膜病变患者体内GPR75表达升高。此外，我们发现敲低GPR75可减缓糖尿病视网膜病变的进展，其保护作用与抑制视网膜神经节细胞线粒体功能障碍有关。腺苷-5′-单磷酸激活的蛋白激酶作为线粒体功能调控因子及细胞能量传感器，被确定为GPR75的新靶点。免疫荧光和共免疫沉淀分析证实了GPR75与AMPK在视网膜神经节细胞中的共定位及相互作用。从机制上讲，GPR75表达升高会抑制AMPK介导的线粒体稳态，从而导致线粒体功能紊乱、能量代谢失衡以及活性氧水平上升，最终引发视网膜神经节细胞的焦亡和凋亡。值得注意的是，AMPK激活剂AICAR能够缓解GPR75引起的线粒体功能障碍、焦亡和凋亡。综上，我们的研究结果表明，靶向抑制GPR75可能成为治疗糖尿病视网膜病变的有效策略。

引言

糖尿病视网膜病变是糖尿病常见的并发症，严重导致全球工作年龄人群的视力丧失甚至失明。糖尿病视网膜病变的进展涉及复杂的机制，目前有效的治疗方法仍然有限[1]、[2]。视网膜神经节细胞是视网膜中唯一的输出神经元，负责整合并传递视觉信息至大脑[3]、[4]、[5]。视网膜神经节细胞功能异常会直接导致糖尿病患者的视力受损[6]、[7]。研究表明，线粒体功能障碍引发的能量代谢紊乱、线粒体动态失衡以及自由基积累，是糖尿病患者视网膜神经节细胞受损并最终发展为糖尿病视网膜病变的主要因素[8]、[9]、[10]、[11]、[12]。有研究指出，P2X7受体是线粒体能量代谢的重要调控因子，与糖尿病视网膜病变的进展密切相关[13]。因此，筛选并识别出能够调控视网膜神经节细胞线粒体稳态的核心分子，有望为阐明糖尿病视网膜病变的发病机制及开发针对性干预策略提供重要突破。

G蛋白偶联受体是细胞膜上最丰富的受体家族，广泛参与多种生理过程的调控[14]、[15]、[16]。在G蛋白偶联受体家族中，G蛋白偶联受体75因其在能量调节和血糖控制方面的作用而备受关注[17]、[18]、[19]。最早关于GPR75的研究是在视网膜领域开展的，该受体被认为可能与年龄相关性黄斑变性有关[20]。另有研究显示，GPR75基因敲除的小鼠会出现与年龄相关的感光细胞丢失现象[21]。尽管已有这些零星的研究报道，但GPR75在视网膜及其相关疾病中的功能仍有待进一步探索。尤其是GPR75在糖尿病视网膜病变中的作用及机制至今尚未有相关研究。现有研究表明，GPR75在脂肪细胞、血管内皮细胞、血管平滑肌细胞以及胰腺β细胞中均有高表达。最近的研究还发现，GPR75在神经元中也有高表达，神经元中缺乏GPR75可防止饮食诱发的肥胖[22]、[23]。不过，GPR75在视网膜神经节细胞中的表达情况及其功能仍不明确。另有研究指出，活化的GPR75可通过诱导活性氧产生而导致血管内皮细胞损伤[24]。在高脂饮食模型中，GPR75会通过促进炎症反应并损害线粒体功能来导致脂肪细胞肥大[18]。然而，GPR75与糖尿病视网膜神经节细胞线粒体功能障碍之间的潜在关联仍有待揭示。

腺苷-5′-单磷酸激活的蛋白激酶是细胞内一种保守的能量传感器，在细胞应激状态下对维持能量平衡起着关键作用[25]、[26]、[27]、[28]。研究表明，激活AMPK可诱发糖尿病视网膜病变中的自噬现象，从而保护视网膜神经节细胞免于死亡[29]。此外，AMPK还能通过维持线粒体动态和活性氧的平衡来调控视网膜神经节细胞中的线粒体稳态[30]、[31]、[32]、[33]、[34]。重要的是，最新研究显示，某些与GPR75同源的G蛋白偶联受体也能通过激活AMPK来维持线粒体稳态[35]、[36]、[37]。不过，目前尚无研究表明GPR75是否能够与AMPK发生相互作用，进而导致糖尿病视网膜病变中视网膜神经节细胞的线粒体功能障碍。

因此，本研究旨在探讨GPR75在糖尿病诱导的视网膜神经节细胞线粒体功能障碍中的作用，并揭示其潜在的机制。

章节节选

实验动物

健康的雄性C57BL/6小鼠，年龄为6–8周，体重为20±2克，购自北京华福康生物科技有限公司（中国北京）。所有小鼠均饲养在无菌实验室中，可自由获取标准实验室饲料和水，生活在温度、湿度恒定且光照时间为12小时/黑暗时间12小时的环境中。所有动物实验均按照国家《实验动物护理和使用指南》的要求进行

糖尿病小鼠及高糖处理的原代视网膜神经节细胞中GPR75表达升高

为探讨GPR75在糖尿病视网膜病变进展中的作用，我们在体内和体外两种环境下检测了GPR75的表达情况。首先，我们通过单次腹腔注射链脲佐菌素建立了糖尿病视网膜病变小鼠模型。此外，参考先前的研究结果[41]，我们通过将原代视网膜神经节细胞置于50 mM高糖环境中培养48小时，模拟糖尿病的慢性高血糖状态，以此建立体外模型。同时，我们使用50 mM甘露醇作为等渗对照，以减轻渗透压带来的影响

讨论

视网膜神经退行性变是糖尿病视网膜病变发展的重要诱因[54]、[55]、[56]、[57]。在本研究中，我们明确了GPR75表达升高在促进视网膜病理改变中的作用，包括视网膜神经节细胞的焦亡和凋亡。从机制上来看，GPR75表达升高会导致AMPK活性下降，进而打破线粒体稳态，引发线粒体功能紊乱、能量代谢失衡，最终

结论

总之，本研究加深了我们对GPR75如何导致视网膜神经节细胞线粒体功能障碍以及糖尿病视网膜病变进展的理解。我们的数据表明，在糖尿病视网膜病变进展过程中，GPR75表达升高会伴随AMPK活性下降。此外，我们发现抑制GPR75的表达可通过恢复AMPK活性来减轻线粒体功能障碍，进而降低视网膜神经节细胞的焦亡和凋亡率，从而延缓糖尿病视网膜病变的进展。因此，降低GPR75的表达水平有望

作者贡献说明

刘梦仁：写作——审阅与编辑，写作——初稿撰写，可视化，验证，监督，软件使用，资源协调，项目管理，方法设计，实验实施，正式分析，数据整理，概念构思。程雪：资金获取，正式分析，数据整理，概念构思。刘文强：正式分析，数据整理，概念构思。于红丹：正式分析，数据整理，概念构思。于胜学：数据整理，概念构思。王亚丽：

资金支持

本研究得到了辽宁省教育厅基金（LJKMZ20221241）、中国辽宁省自然科学基金（2023-MS-312）以及全国大学生创新创业训练计划（202410160012）的支持。

声明

伦理审批与参与同意：本文所述的全部实验程序均已获得锦州医科大学动物实验伦理委员会的批准。

发表同意：无需。

利益冲突声明

作者声明，他们不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。

致谢

我们要感谢所有参与本研究的参与者。同时，我们也感谢Figdraw提供的绘图工具。