通过腺苷脱氨酶调控的Aptakiss电路结合发夹管放大技术，实现PAM界面的比率型ECL/SERS检测

《Biosensors and Bioelectronics》：Adenosine Deaminase-Regulated Aptakiss Circuit Coupled with Hairpin-Tube Amplification for Ratiometric ECL/SERS Detection at a PAM Interface

　　罗启生|魏毅|张春园|郑传华|梁鸿渠|秦德岭|魏伟|梁凌环|任浩振|黄悦|唐千莉|张凯|廖贤久中国广西壮族自治区百色市533000，右江民族医学院附属医院，广西骨关节退行性疾病临床前与转化研究重点实验室神经外科摘要腺苷脱氨酶（ADA）是一种关键的嘌呤代谢酶，它能催化腺苷脱氨生成肌苷，与免疫调节、炎症以及疾病相关的代谢紊乱密切相关。本研究通过整合腺苷调控的aptakiss识别模块、发夹管介导的界面放大反应，以及CsPbBr3@PDA@AuNPs/MXene（PAM）修饰的玻璃碳电极，开发出一种对ADA响应的比率型电化学发光/表面增强拉曼散射（ECL/SERS）生物传感器。在缺乏ADA的情况下，腺苷会促进DNA1/DNA2/腺苷aptakiss复合物的形成，进而导致DNA3释放，并激活PAM/GCE界面上的发夹管反应。由此产生的循环位移会将DNA4-Fc吸引到电极上，产生强烈的Fc相关SERS信号，同时抑制基于CsPbBr3的ECL发射。相反，ADA会将腺苷转化为肌苷，阻止aptakiss复合物的形成，抑制DNA3的释放，减少DNA4-Fc的积累，从而导致较高的ECL信号和较低的SERS信号。由于这两种信号呈反相关关系，比率信号R = IECL/ISERS会随着ADA活性的增加而上升。在优化条件下，标准化后的ECL和SERS信号在0.001-10 U L-1的ADA浓度范围内均呈现良好的浓度依赖性趋势，比率校准后的检测下限为0.0022 U L-1。该生物传感器还表现出良好的选择性、重复性、电极间一致性、操作稳定性、储存稳定性以及SERS空间均匀性，显示出其在可靠检测ADA活性方面的潜力。引言腺苷脱氨酶（ADA）是嘌呤代谢中的重要酶，能催化腺苷不可逆地脱氨生成肌苷（Qiu等人，2025；Wang等人，2019；Zhang等人，2014）。这一反应可调节腺苷的平衡状态，影响免疫激活、炎症信号传导以及细胞代谢。由于异常的ADA活性与免疫功能障碍、炎症性疾病、感染及恶性疾病有关，因此，灵敏且可靠的ADA活性检测对于生化研究和临床分析而言极为重要。传统的ADA检测方法通常基于分光光度法、比色法、色谱法、电化学法或荧光法。尽管这些方法有用，但可能存在灵敏度不足、样品预处理复杂、自校准能力差或抗基质干扰能力有限等问题。因此，亟需构建一种能够将ADA酶活性转化为稳定、放大且可自我验证的分析信号的生物传感策略。对腺苷响应的kissing-complex或aptakiss系统为ADA检测提供了直接的分子基础。在这种系统中，腺苷会诱导aptaswitch折叠，并通过环-环识别促进其与aptakiss链的结合（Barth等人，2016；Wei等人，2026；Zhang等人，2016；Zhao等人，2018）。一旦存在ADA，腺苷就会被转化为肌苷，此时依赖腺苷的aptakiss复合物就无法有效形成。因此，ADA活性可转化为对可编程核酸组装事件的抑制。这种分子转换特别适合与后续的DNA扩增和界面信号调控相结合（Durand等人，2014；Wei等人，2026）。DNA纳米结构引导的界面反应也为生物传感器设计提供了另一种有用工具（Snider等人，2025；Tian等人，2026；Yuan等人，2025a）。与随机固定的探针相比，框架核酸结构和管状DNA组装结构能够提供有序的方向、可控的间距、更高的局部浓度以及更强的反应效率。类似的界面设计原理也在光电化学生物检测系统中得到了应用。例如，一种基于回文分子信标的Z型BiOCl-Au-CdS光电化学平台，利用合理的DNA构象转换和核酸扩增来调节界面信号转导（Zeng等人，2019）。此外，一种基于CRISPR-Cas12a的光电化学生物传感器表明，可编程的核酸识别和切割反应可以与界面光电化学读出相结合，用于即时核酸诊断（Zeng等人，2022）。这些研究都表明，合理设计的核酸探针和受DNA调控的界面反应能够提高局部反应效率和分析性能。在本系统中，引入了发夹管界面，将上游的DNA3释放事件转化为电极表面的循环位移和DNA4-Fc的聚集（He等人，2026；Peng等人，2025；Yang等人，2025）。双模式ECL/SERS生物传感通过结合两种独立的信号输出，进一步提高了分析的可靠性。ECL具有低背景、高灵敏度以及电化学可寻址性，而SERS则能提供分子指纹信息、窄光谱特征以及在等离子体热点附近的强增强效应。最近，通过DNA walker扩增和原位合成信号探针，已经开发出了用于循环miRNA分析的双模式SERS-ECL生物传感器，这减少了信号泄漏，提高了分析的可靠性（Zhang等人，2024）。此外，关于SERS相关双模式光学基底的最新综述也指出，整合两种相互支持的光学信号是提高复杂样品中分析置信度和抗基质干扰能力的有效途径（Wang等人，2025a）。当这两个信号通道呈相反变化时，比率读出可以减少电极间差异、光学波动以及局部热点的不均匀性。这种自校准概念也在比率型光电化学传感中得到了验证。例如，一种采用λ-外切核酸酶辅助回收扩增的3D打印双信号光电化学装置，通过在受控的装置结构中整合两种信号通道，实现了比率型生物标志物读出（Zhang等人，2019）。在另一项代表性研究中，一种基于上转换纳米晶并可在自制3D打印装置上进行空间分辨读出的双通道光电化学比率型aptasensor，通过分离和比较两种光电化学响应，提高了分析的可靠性（Qiu等人，2019）。这些研究都表明，双信号或双通道比率策略可以通过利用一种响应作为另一种响应的内部校正，从而提高信号的可靠性。受到这些比率读出原理的启发，本研究利用反相关的ECL和SERS信号，构建了R = IECL/ISERS这一作为ADA活性检测的自校准参数。最近的方法学进展进一步表明，可靠的双模式生物传感需要兼具互补的信号读出设计和合理的界面工程。正如上述SERS/SEF双模式基底研究所示，整合两种光学信号可以提高分析的置信度，拓宽光学传感平台的应用范围。此外，共自组装单层膜支持的SERS界面研究表明，分析物富集、热点捕获以及表面微环境调控对于提高复杂样品中SERS的灵敏度和重复性至关重要（Yuan等人，2025b）。与此同时，ECL传感也已扩展到生物和环境基质中的选择性检测，例如用于恩诺沙星分析的分子印迹ECL传感器（Wang等人，2022）。设备级的整合，如旋转式纸基ECL免疫检测装置，进一步凸显了便携式、集成化以及多路复用型ECL格式在实用生物分析中的重要性（Sun等人，2018）。这些研究共同表明，稳定的功能界面、高效的信号放大以及自校准的双模式读出是构建稳健生物传感器的关键。因此，本研究设计了aptakiss-发夹管/PAM结构，旨在将酶调控的分子转换、有序的DNA界面放大以及反相关的ECL/SERS自校准功能整合到同一个传感界面中。尽管取得了这些进展，但使用双模式ECL/SERS生物传感器进行酶活性分析仍面临一些挑战。首先，许多已报道的ECL/SERS平台主要针对核酸、蛋白质或转录因子，而酶活性检测则需要额外的分子转换步骤，才能将催化活性转化为可编程的界面信号。其次，非特异性报告基因泄漏、SERS热点不均匀性、电极间差异以及基质干扰都可能影响单输出或弱相关双输出平台的准确性。第三，目前仍难以将酶调控的分子识别、有序的DNA纳米结构引导的界面放大以及稳定的多功能ECL/SERS换能器整合到同一个传感界面中。最近，基于CsPbBr3@PDA@AuNPs/MXene的PAM支持型ECL/SERS平台已经证明，钙钛矿衍生的ECL发射和AuNP介导的SERS增强效果可以在同一电极界面上实现耦合，从而实现自校准的生物传感（Guo等人，2026；Luo等人，2026；Wei等人，2026）。此外，PDA稳定的CsPbBr3@AuNPs界面还被证明可以提高基于钙钛矿的ECL系统的水相稳定性和电荷转移性能（Guo等人，2026；Luo等人，2026；Wei等人，2026）。基于以上考虑，本研究的主要目的是解决一些ADA活性检测和单输出生物传感平台仍然存在的自校准能力不足、抗基质干扰能力有限以及酶活性向信号转换效率低的问题。其主要目标是构建一种受ADA调控的比率型ECL/SERS生物传感器，将该酶催化的腺苷脱氨作用转化为一种反相关且可自我验证的双模式信号。为实现这一目标，本研究将腺苷调控的aptakiss识别电路、发夹管介导的界面放大反应以及PAM支持的ECL/SERS换能器整合到了同一个传感界面中。在该设计中，ADA决定了腺苷是否能够促使DNA1/DNA2 aptakiss复合物的形成。在没有ADA的情况下，DNA3会被释放出来，激活发夹管介导的DNA4-Fc聚集，从而产生SERS增强效应和ECL信号减弱。而在有ADA存在时，腺苷会被消耗，DNA3的释放会被阻断，Fc的积累也会受到抑制，此时系统会出现ECL信号恢复和SERS信号减弱的现象。该策略的创新之处在于三点：首先，ADA活性被转化为可编程的aptakiss调控的DNA3释放/抑制事件；其次，发夹管界面能够限制循环位移，增强电极表面的DNA4-Fc聚集；最后，PAM复合界面则整合了基于CsPbBr3的ECL发射、AuNP介导的SERS增强效应以及Au-S锚定功能，同时还具备PDA辅助的界面稳定作用和MXene促进的电子传输功能。因此，通过比率信号R = IECL/ISERS，可以实现高效且可自我验证的ADA活性检测。部分内容试剂与材料腺苷脱氨酶（ADA）、腺苷、肌苷、盐酸多巴胺、HAuCl4、CsBr、PbBr2、TCEP、MCH、Tris-HCl、MgCl2、NaCl、KCl、PBS、TPrA、乙醇以及其他分析级试剂均从商业供应商处购买，无需进一步纯化即可使用。Ti3AlC2粉末用于制备Ti3C2 MXene。所有的寡核苷酸，包括DNA1/aptaswitch、DNA2/aptakiss、DNA3、H1、H2、DNA4-Fc、Clip A-D和CP，均经过HPLC纯化，其序列列于表S1中。DNA储备液所提出的生物传感器原理如图1所示，该ADA响应型双模式ECL/SERS生物传感平台是通过整合腺苷调控的aptakiss识别模块、基于PAM的界面信号转导层以及发夹管介导的放大界面而构建的。整个设计包含三个功能层面：PAM/GCE换能器的构建、ADA调控的腺苷/aptakiss调节，以及用于实现反相关ECL/SERS读出的界面循环放大。图1结论总之，本研究通过整合腺苷调控的aptakiss识别、发夹管介导的界面放大以及PAM支持的双模式换能器，成功开发出一种对ADA响应的比率型ECL/SERS生物传感器。在缺乏ADA的情况下，腺苷会促进DNA1/DNA2 aptakiss复合物的形成以及DNA3的释放，这会激活发夹管引起的循环位移，进而将DNA4-Fc吸引到PAM/GCE界面。积累的Fc会增强SERS响应，同时抑制基于CsPbBr3的CRediT作者贡献说明唐千莉：指导、资源提供、正式分析。黄悦：软件、方法学、正式分析。廖贤久：验证、资源提供、项目管理。魏毅：软件、研究、数据整理。张凯：项目管理、资金获取、正式分析。罗启生：写作——审稿与编辑、写作——初稿撰写、概念构思。郑传华：可视化、指导、方法学。张春园：验证、正式分析、数据整理。梁鸿渠利益冲突所有作者均声明没有相关的利益关系。利益冲突声明? 作者声明他们没有已知的、可能影响本文所述工作的财务利益或个人关系。致谢我们衷心感谢广西壮族自治区自然科学基金（2025GXNSFHA069115）、广西骨关节退行性疾病基础与转化研究重点实验室（2021-220-06-202205）、百色市生物医学分析化学与临床分子诊断重点实验室（2022-38-05）、百色市生物分析化学应用与临床分子诊断工程研究中心（2021-22-09）等机构的财政支持。