一种新型组蛋白去乙酰化酶抑制剂抑制脂质积累并改善载脂蛋白E缺陷小鼠的动脉粥样硬化

《Chemico-Biological Interactions》：A novel histone deacetylase inhibitor suppresses lipid accumulation and ameliorates atherosclerosis in apolipoprotein E-deficient mice

　　

组蛋白去乙酰化酶2（HDAC2）关键地调控巨噬细胞炎症反应和脂质代谢，但其作为动脉粥样硬化（AS）治疗靶点的潜力尚未完全确定。该研究探讨了HDI-1（一种新型选择性HDAC2抑制剂）在AS中的治疗效果和分子机制。研究人员采用荧光亲和分析和分子对接评估HDI-1与HDAC2的结合。在PMA分化的THP-1巨噬细胞中，通过Western blot、油红O染色和免疫荧光评估组蛋白乙酰化、脂质积累和脂质转运体（ABCA1、CD36）的表达。还测量了活性氧（ROS）水平和Nrf2/HO-1通路激活。在体内，研究人员在喂食高脂饮食的ApoE^-/-小鼠中检测了HDI-1的功效。HDI-1显示出对HDAC2的高结合亲和力，选择性抑制其活性，并显著增加H3K9和H3K27乙酰化。在巨噬细胞中，HDI-1通过上调ABCA1和下调CD36，浓度依赖性地减少氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）摄取和脂质积累。此外，HDI-1激活Nrf2/HO-1通路，抑制ROS生成，减轻氧化应激。在ApoE^-/-小鼠中，HDI-1处理减弱了主动脉斑块形成并改善了相关的病理变化。通过选择性靶向HDAC2，HDI-1协调调节巨噬细胞脂质代谢和氧化应激反应，有效减缓了AS进展。这些发现将HDI-1定位为AS的一个有前景的治疗候选药物。

动脉粥样硬化（atherosclerosis, AS）是一种以脂质沉积、慢性炎症反应和血管壁结构重塑为特征的复杂心血管疾病，是全球发病率和死亡率的主要原因。尽管以他汀类和PCSK9抑制剂为代表的降脂治疗在人群水平上显著降低了心血管风险，但他汀类药物可能引发严重的、危及生命的不良反应。因此，探索治疗AS的新策略具有重要的研究意义。巨噬细胞在AS的发生、进展和斑块失稳中发挥核心调控作用，其摄取氧化低密度脂蛋白（ox-LDL）后形成泡沫细胞，促进脂质核心扩张和炎症级联反应放大。脂质通路的调节中，清道夫受体CD36是巨噬细胞摄取ox-LDL的主要介质，而ATP结合盒转运体ABCA1是胆固醇流出和HDL生成的关键限速步骤。促进胆固醇流出同时抑制脂质摄取不仅能减少巨噬细胞内脂质积累，还能重塑其炎症表型，对AS进展发挥双重保护作用。此外，氧化应激是AS的另一核心致病驱动因素，活性氧（ROS）过量生成不仅促进LDL氧化，还激活多种促炎信号通路，加剧血管损伤。核因子E2相关因子2（Nrf2）及其下游抗氧化酶血红素加氧酶-1（HO-1）构成关键的细胞内抗氧化防御系统，在限制斑块炎症和维持组织稳态中起重要作用。近年研究表明，表观遗传调控，特别是组蛋白去乙酰化酶（HDACs）家族，在AS发病和进展中发挥重要作用。HDAC2通过协调调节力学传导、氧化应激、炎症反馈和血管重塑等关键过程，深度参与AS各个阶段的斑块形成与进展，被认为是潜在的治疗靶点。然而，以往研究多依赖广谱HDAC抑制剂，难以归因于特定亚型，且限制了临床转化潜力。

研究人员开展了一项系统性研究，以新型选择性HDAC2抑制剂HDI-1为工具，在细胞和动物水平上探究其抗AS效应及分子机制。研究得到以下结论：HDI-1通过选择性抑制HDAC2的催化活性，显著增强组蛋白H3K9和H3K27乙酰化水平；在巨噬细胞中，HDI-1通过上调ABCA1和下调CD36，剂量依赖性地减少ox-LDL摄取和脂质积累，抑制泡沫细胞形成；同时，HDI-1激活Nrf2/HO-1抗氧化通路，抑制ROS生成并恢复超氧化物歧化酶（SOD）活性，减轻氧化应激；在内皮细胞中，HDI-1抑制ox-LDL诱导的内皮-间充质转化（EndoMT），表现为上调内皮标志物CD31和VEGFR2，下调间充质标志物Vimentin和转录因子Snail，并抑制MMP2/9表达及细胞迁移。在体内，高脂饮食喂养的ApoE^-/-小鼠模型中，HDI-1处理显著减少主动脉各节段斑块面积，降低血清低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、总胆固醇（TC）和甘油三酯（TG）水平，改善高脂血症；免疫荧光分析显示HDI-1减少斑块内F4/80/CD36双阳性巨噬细胞数量，并部分逆转EndoMT相关标志物的异常表达模式，上调CD31、下调Vimentin。这些发现表明，HDI-1通过同时调节巨噬细胞脂质代谢和内皮功能障碍，有效延缓AS进展，为选择性HDAC2靶向治疗AS提供了概念验证。该论文发表在《Chemico-Biological Interactions》。

研究人员开展研究采用的关键技术方法主要包括：荧光亲和分析（fluorescence affinity assays）评估HDI-1与HDAC2的结合；分子对接（molecular docking）预测结合自由能；Western blot检测蛋白表达和组蛋白乙酰化水平；油红O染色（Oil Red O staining）和Dil-ox-LDL荧光摄取实验评估脂质积累；免疫荧光（immunofluorescence）定位和半定量分析；ROS水平和SOD活性检测；细胞划痕实验（wound healing assay）评估迁移能力；小干扰RNA（siRNA）转染技术敲低HDAC2以验证靶点特异性。动物模型采用雄性载脂蛋白E基因敲除（ApoE^-/-）小鼠（6-8周龄，购自GemPharmatech Co., Ltd.，苏州），通过高脂饲料（含15%脂肪和1.25%胆固醇）诱导AS。

研究结果详述如下：

**3.1. HDI-1抑制HDAC2催化活性并显著增强组蛋白H3乙酰化**：通过HDAC活性测定，HDI-1以低细胞毒性（IC₅₀约1.8 μM）处理巨噬细胞，显著抑制总HDAC活性。免疫沉淀亚型特异性HDAC复合物后的酶活测定显示，HDI-1对HDAC2的抑制率达81%，而对HDAC1、HDAC3和HDAC8无显著抑制。分子对接证实HDI-1与HDAC2的结合自由能最低（-8.1 kcal/mol），通过疏水作用、氢键和π-π堆积稳定结合。Western blot分析表明HDI-1不改变HDAC2蛋白表达，但显著上调H3K9ac和H3K27ac水平，与广谱抑制剂SAHA效果相当。

**3.2. HDI-1减少PMA诱导的巨噬细胞脂质沉积**：油红O染色和荧光强度定量显示，HDI-1（25、50、100 nM）剂量依赖性地降低ox-LDL处理后的细胞内脂质积累，100 nM时减少超过85%。HDAC2 siRNA敲低显著减少脂质积累，且HDI-1在敲低细胞中不再进一步降低脂质，提示HDI-1的效应依赖于HDAC2。

**3.3. HDI-1调节PMA诱导的巨噬细胞中ABCA1和CD36的表达**：免疫荧光染色和Western blot分析显示，与模型组相比，HDI-1处理剂量依赖性地升高ABCA1蛋白水平，降低CD36蛋白水平。HDAC2敲低本身即可上调ABCA1、下调CD36，与HDI-1效果相似，而敲低后加HDI-1处理不再引起显著变化，表明HDI-1通过抑制HDAC2调节这两个转运蛋白的表达。

**3.4. HDI-1抑制泡沫细胞中ROS生成并激活Nrf2抗氧化通路**：DCFH-DA荧光探针检测显示，泡沫细胞中ROS水平显著升高，SOD活性降低；HDI-1处理剂量依赖性地降低ROS、恢复SOD活性。Western blot结果表明，模型组Nrf2和HO-1表达下调（Nrf2降低80%以上），HDI-1则呈剂量依赖性上调两者。HDAC2敲低显著减少ROS产生，HDI-1在敲低细胞中无额外效应。

**3.5. HDI-1抑制ox-LDL诱导的EndoMT和内皮细胞迁移**：免疫荧光和Western blot显示，ox-LDL处理HUVECs诱导EndoMT，内皮标志物CD31和VEGFR2降低，间充质标志物Vimentin和转录因子Snail升高；HDI-1处理剂量依赖性地逆转这些变化。同时，HDI-1抑制MMP2和MMP9的表达，并通过划痕实验证实可减弱ox-LDL促进的HUVECs迁移。

**3.6. HDI-1减轻ApoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块形成并改善高脂饮食诱导的血脂异常**：体内实验显示，HDI-1处理35天（20 μg/kg，皮下注射隔天给药）后，小鼠体质量无显著差异，耐受性良好。整体主动脉油红O染色和主动脉根部切片染色均显示，HDI-1显著减小各节段斑块面积。H&E染色进一步确认斑块面积减少。血清脂质分析显示，HDI-1显著降低升高的LDL-C、TC和TG水平。

**3.7. HDI-1抑制斑块内巨噬细胞CD36表达和EndoMT**：免疫荧光共染色显示，斑块内巨噬细胞（F4/80阳性）中CD36呈高表达，HDI-1处理后F4/80/CD36双阳性细胞数量减少，提示巨噬细胞相关脂质摄取减弱。此外，HDI-1增加斑块区CD31信号，降低Vimentin表达，说明在体内抑制了EndoMT过程。

在讨论部分，研究人员指出AS不仅是脂质储存紊乱，更是由持续性表观遗传和代谢重编程驱动的细胞适应不良状态。HDACs在AS发病中起关键作用，但以往研究多用广谱抑制剂。HDI-1作为选择性HDAC2抑制剂，在巨噬细胞中重构染色质架构，恢复脂质和氧化还原稳态，调节斑块进展。研究验证了HDI-1通过调控CD36/ABCA1轴和Nrf2/HO-1通路减少泡沫细胞形成，通过抑制EndoMT和迁移相关MMP表达保护内皮完整性。但研究未明确这些基因是否为HDAC2的直接转录靶点，且仅评价了单一剂量，需进一步药代动力学和剂量-反应研究。未来需结合纵向评估和细胞特异性遗传模型、谱系追踪及单细胞转录组学以全面理解HDI-1的体内治疗机制。

研究结论部分翻译如下：本研究提示，HDI-1通过促进ABCA1介导的胆固醇外流和抑制CD36相关的脂质摄取，有效减弱巨噬细胞脂质累积和泡沫细胞形成。此外，HDI-1部分通过抑制ROS生成和激活Nrf2/HO-1通路减轻氧化应激，同时与抑制ox-LDL诱导的EndoMT相一致。在ApoE^-/-小鼠中，HDI-1处理延缓了斑块进展，改善了斑块稳定性，并改善了高脂饮食诱导的高脂血症。机制上，HDI-1减少了斑块区域内巨噬细胞相关的F4/80/CD36双阳性信号，并部分逆转了EndoMT相关改变，与其体外观察到的保护效应一致。总体而言，这些发现表明HDI-1可能通过调节脂质代谢、氧化应激和EndoMT发挥抗动脉粥样硬化效应，凸显其作为AS治疗候选药物的潜力。