综述：无细胞RNA在液体活检中的应用

《Critical Reviews in Oncology/Hematology》：Application of cell-free RNA in liquid biopsy

　　赵小南|顾希林|邢宝洲|王珍|楚海荣|李红|张丽中国山东省潍坊市261053，山东第二医科大学基础医学院摘要基于无细胞RNA的液体活检技术正在推动无创诊断的发展，使该领域从以基因组学为焦点的静态研究转向以功能转录组学为核心的动态研究。循环肿瘤DNA主要反映基因变异情况，而无细胞RNA则通过捕捉实时的基因表达、剪接变化、非编码调控以及转录后修饰，提供了不同的信息维度，从而更全面地展现疾病生物学特征。本综述系统阐述了无细胞RNA的分子特性、现有的分析技术及其在早期癌症检测、分子分型以及妊娠并发症预测等临床领域的应用。此外，还探讨了片段组学、表转录组学以及微生物来源的无细胞RNA等新兴研究方向。同时，也分析了当前在标准化、灵敏度及临床验证方面存在的挑战。随着多组学整合和人工智能技术的进步，无细胞RNA有望从辅助生物标志物发展成为用于早期疾病检测、长期监测以及个性化治疗的核心技术。本综述旨在梳理该领域的现状，明确面临的瓶颈，并提出实现无细胞RNA在临床常规应用的具体路径。

引言液体活检通过检测和分析血液等体液中的生物标志物，解读与疾病相关的信息，以无创且动态的监测方式支持精准医疗。与传统组织活检相比，这项技术具有三大优势：首先，其无创特性大大降低了采样风险，减轻了患者的痛苦；其次，它能够实现动态监测，实时持续追踪疾病的进展、治疗反应及复发风险；第三，它的检测范围更为广泛，有助于克服肿瘤的异质性，更全面地了解全身各处肿瘤的分子特征，包括转移性病灶（Martinelli等人，2025；Pi?eiro-Pérez等人，2022）。凭借这些优势，液体活检在早期癌症检测、分子分型、治疗效果评估以及预后预测等方面具有巨大的临床潜力。此外，其应用范围也在逐步扩展到产前诊断、移植后监测以及传染病的诊断和治疗等领域（Loy等人，2024）。目前，液体活检的研究与应用主要集中在三种核心生物标志物上：循环肿瘤DNA、循环肿瘤细胞以及细胞外囊泡RNA/无细胞RNA。循环肿瘤DNA携带与肿瘤相关的基因组变异信息，包括点突变、拷贝数变异及甲基化修饰，因此是目前临床应用中最成熟的液体活检生物标志物（Loy等人，2024）。循环肿瘤细胞是进入外周血液循环的完整肿瘤细胞，可用于对细胞形态、表面标志物以及单细胞基因组进行多层面分析。不过，它们在血液中的含量极低，这在高效富集和准确检测方面带来了显著的技术挑战，亟需解决（Ladurner等人，2021）。小型细胞外囊泡和游离的RNA分子则是丰富的基因表达信息来源。这类被脂质包裹的结构携带着多种生物分子，包括脂质和蛋白质，并拥有保护其遗传内容的稳定屏障（Kim等人，2023；Xiao和Sluijter，2025）。大约十年前，研究重点开始转向这类囊泡，因为人们认为其膜结构更有利于保持RNA的完整性，从而更适合用于液体活检。然而，Giménez Capitán等人2023年的研究得出了不同结论。他们将28份来自囊泡的样本与56份未结合RNA的样本进行比较，发现提取囊泡所需的复杂流程往往会导致RNA内容物的严重降解，从而导致数据质量较差，检测率仅为22.2%左右（Giménez-Capitán等人，2023）。相比之下，无细胞RNA在这项研究中显示出更高的可靠性，具有更丰富的转录组特征（H. Wang等人，2024）。不过，也需要客观看待两者的优劣：外泌体来源的无细胞RNA能更好地抵御内源性RN酶的侵蚀，在储存过程中更加稳定，还能富集那些在游离无细胞RNA中占比较低的组织特异性小RNA种类。而普通无细胞RNA则能提供更高的总RNA产量，处理流程更为简单，且更易于获取长RNA分子，便于进行转录组分析。因此，选择囊泡包裹型还是游离无细胞RNA，应依据具体的临床需求、目标RNA种类以及现有的技术条件来决定。在液体活检中，最常用的核酸标志物是无细胞DNA，因为它比无细胞RNA更具稳定性。但在实际临床中，从外周血中分离出足够量的肿瘤来源无细胞DNA往往十分困难，这会影响后续的检测与分析工作。而无细胞RNA作为特定基因的表达产物，其在体液中的浓度大约是无细胞DNA的20倍，这是因为一个基因可以经历多轮转录过程（Raez等人，2021）。此外，无细胞RNA仅反映与肿瘤进展密切相关的突变，有助于定量评估肿瘤基因的表达水平（Raez等人，2021）。同时，无细胞RNA还包含多维度的分子信息，如基因融合、可变剪接、非编码RNA（如长链非编码RNA和环状非编码RNA）以及RNA的化学修饰，这些都是对循环肿瘤DNA的重要补充。在基因融合的检测方面，通过无细胞DNA测序可以间接根据断裂点推断基因融合情况，但无法区分无表达的惰性融合与有表达的驱动融合，这可能导致假阴性或假阳性结果。其检测灵敏度差异较大，介于18%至83%之间，且取决于断裂点的覆盖程度。相比之下，无细胞RNA的检测更适用于全面筛查，可直接针对表达产物进行分析（Giménez-Capitán等人，2023）。研究表明，基于无细胞RNA的检测策略能够有效识别肺癌中的ALK和ROS1等融合基因（Hasegawa等人，2021；Nesselbush等人，2025），同时也有助于对各类非编码RNA的功能进行全面分析（De Sota等人，2024；Tao等人，2023）。Giménez-Capitán等人利用nCounter和数字PCR技术，在胸腔积液和腹水上清液等多种液体样本中检测了基因融合情况，成功识别出了ALK、ROS1、RET融合以及MET第14外显子跳跃突变，整体检测灵敏度达到了87.5%（Giménez-Capitán等人，2023）。此外，由于无细胞RNA的表达谱具有很高的组织特异性，因此可用来追踪疾病进程，更精准地定位原发肿瘤部位（Larson等人，2021；Valadi等人，2007）。随着无细胞RNA在液体活检中的应用越来越重要，本综述对该领域进行了系统性的梳理。首先介绍了这类分子的基本生物学特性以及目前用于研究它们的方法，随后概述了其在癌症治疗、产前健康以及其他多个医学领域的广泛应用。本文还深入分析了当前在实验操作、生物学复杂性以及从研究阶段向临床应用转化过程中存在的问题。最后，探讨了未来可能影响该领域发展的新方向与趋势。我们的目标是为一线研究人员和临床医生提供有益参考，助力缩小实验室研究成果与实际患者诊疗之间的差距。需要说明的是，本综述属于系统性叙述性综述，采用了系统的文献检索方法，并未运用PRISMA标准、正式的偏倚风险评估工具或定量元分析方法。本综述的范围和局限性：鉴于期刊定位，本文主要聚焦于肿瘤学领域的应用，非肿瘤学应用则在单独章节中简要介绍。详细的RNA提取方案、生物信息学分析流程的对比以及各地的监管框架均不在本综述的讨论范围内。

片段摘录无细胞RNA的生物学起源与存在形式无细胞RNA存在于多种体液中，包括血液。由于其复杂的生物学起源和多样的存在形式，它的分子结构本质上并不稳定，且含量相当低（见图1）。无细胞RNA的产生主要有两条途径。第一条途径是活细胞主动分泌，通过外泌体如外泌体和微囊泡，或将特定RNA分子释放到细胞外环境中；另一条途径则是通过与某些物质形成复合物来实现。无细胞RNA在疾病诊断与监测中的应用全景无细胞RNA是一类能够动态且无创地反映机体转录状态的信号分子，无需进行侵入性组织取样，即可检测多个器官中的组织特异性基因表达情况（Koh等人，2014）。其临床应用范围已从肿瘤学迅速扩展到围产期医学、器官移植监测以及多种慢性疾病领域，为早期疾病检测、疗效评估提供了前所未有的全面视角。前沿进展：超越表达丰度的新的研究维度随着研究的深入，对无细胞RNA的分析已不再仅仅局限于测定其类型和数量。无细胞RNA的多维度分子特征为其作为精准诊断标志物提供了有力依据。如图4所示，无细胞RNA在血液循环中主要以高度片段化的形式存在，片段长度通常低于200个核苷酸（Chen等人，2022）。这些片段的切割并非随机发生，这种切割模式有助于区分肿瘤细胞与正常细胞。核心挑战从样本采集到实际临床应用，整个过程包含七个独立阶段（见图5）。这七个阶段涵盖了完整的分析流程：（1）从血浆、尿液或其他生物液中采集生物样本；（2）预分析处理，包括离心和过滤；（3）采用磁珠法或柱层析法提取并富集无细胞RNA；（4）制备全转录组文库或捕获型文库；（5）利用下一代测序技术进行高深度测序。结论基于无细胞RNA的液体活检技术快速发展，标志着无创疾病诊断正从基因组时代迈向转录组时代。本综述清楚地表明，无细胞RNA并非简单替代循环肿瘤DNA，而是液体活检分析中不可或缺的补充和延伸。作为一种实时反映基因表达活性的指标，无细胞RNA将液体活检所提供的信息从静态的基因谱型转变为对功能状态的动态反映。

材料与方法本综合性叙述性综述是通过系统性的文献检索方法完成的。由于属于叙述性综述，因此未采用PRISMA要求的正式偏倚风险评估或定量元分析方法。我们使用了PubMed、Web of Science和Google Scholar数据库，检索关键词包括“cell-fRNA”“cfRNA”“液体活检”“循环RNA”以及“转录组学”。优先考虑2015年至2025年间发表的文章，尤其关注相关领域的重要研究。批判性观点本综述系统地阐述了无细胞RNA液体活检领域的研究现状，其核心价值在于将无细胞RNA在学术地位上从循环肿瘤DNA的“辅助元素”提升为“独立且具有决策意义的核心因素”。通过整合片段组学、表转录组学以及微生物组学等多维度数据，本综述不仅总结了当前的研究进展，还指出了制约该技术发展的关键结构瓶颈。作者贡献X.Z.负责构思综述框架并撰写初稿；X.G.负责数据整合与可视化处理；B.X.和Z.W.承担文献检索工作；L.Z.、H.L.和H.C.负责项目监督并修改稿件。所有作者均参与了终稿的审阅与确认。未引用参考文献（Hammond等人，2000；Leong等人，2024；Moufarrej等人，2022；Risitano等人，2012；Vorperian和Moufarrej，2022；Wan等人，2025；Wang等人，2024）关于写作过程中生成式AI及AI辅助技术的声明在撰写本文时，作者使用了Gemini工具来优化部分较为口语化的表达。在使用该工具后，作者对内容进行了必要的审核与修改，并对最终发表文章的内容负全责。利益冲突声明作者声明不存在任何可能影响本文研究结果的已知财务利益或个人关系。致谢我们感谢北京中国脑科学研究院基因组学中心的所有成员，感谢他们提出的宝贵意见与建议。同时，我们也感谢国家自然科学基金（项目编号32370682）以及潍坊市科技发展计划（2023GX027）的支持。此外，我们也感激那些通过已发表研究成果为我们理解无细胞RNA液体活检技术做出贡献的各位学者。利益声明作者声明不存在任何利益冲突。