超声辅助天然低共熔溶剂提取龙井茶儿茶素：工艺优化与生物活性评价

《Industrial Crops and Products》：Ultrasound-assisted NADES extraction of catechins from Longjing tea: Process optimization and bioactivity evaluation

　　

超声辅助天然低共熔溶剂（NADES）提取实现了从龙井茶中高效回收儿茶素。NADES_9（基于L-脯氨酸/尿素）在测试溶剂中表现出优越的提取性能。采用响应面法（RSM）和遗传算法-反向传播神经网络（GA-BP）进行工艺优化，两者在预测和一致性方面具有互补优势。富含儿茶素的提取物通过核因子κB（NF-κB）/NOD样受体蛋白3（NLRP3）通路减轻炎症。

本研究旨在开发一种基于超声辅助天然低共熔溶剂（UAE-NADES）的绿色提取策略，用于从龙井绿茶中高效富集五种主要儿茶素，并评估其对肥胖相关哮喘（OA）的保护作用及分子机制。OA是哮喘的一种特殊临床表型，常伴有严重症状和对常规治疗反应性降低，而绿茶多酚（尤其是儿茶素）具有抗氧化和抗炎活性，但缺乏高效的绿色提取方法及在OA中的系统评价。

研究人员首先比较了不同溶剂系统的提取效率，筛选出NADES_9（L-脯氨酸/尿素）为最优溶剂。随后通过单因素实验和响应面法（RSM）结合Box-Behnken设计（BBD）以及遗传算法-反向传播神经网络（GA-BP）模型优化关键工艺参数（提取温度、超声时间、NADES水含量、液固比）。在优化的条件下，利用高效液相色谱（HPLC）验证提取效果。然后，通过高脂饮食（HFD）和星尘螨（HDM）联合诱导建立OA小鼠模型，分别给予水、75%乙醇或NADES_9制备的绿茶提取物（剂量300 mg/kg，基于原料质量归一），评估其对气道炎症、组织病理损伤、血脂紊乱的改善作用。进一步采用非靶向代谢组学（LC-MS）和转录组测序分析差异代谢物和差异表达基因（DEGs），结合分子对接（CDOCKER算法）和蛋白免疫印迹（Western blot）实验验证关键分子机制。实验所用龙井茶样品来自浙江建德，OA小鼠模型使用C57BL/6J雄性小鼠（6周龄），动物实验经浙江中医药大学动物伦理委员会批准。

**3.1 萃取溶剂的筛选**
通过总酚含量（TPC）评估不同溶剂的提取效率，结果表明NADES系统总体优于水和75%乙醇，其中NADES_9（L-脯氨酸/尿素/水=1:1:3）表现出最高的TPC（>180 mg GAE/g），主要归因于其含有的L-脯氨酸作为氢键受体（HBA）以及尿素提供的额外氢键位点，同时低粘度水和超声空化效应增强了传质。

**3.2 校准曲线的制备**
HPLC分析显示，混合标准品和NADES_9提取物在280 nm处均出现五个特征峰，对应表没食子儿茶素（EGC）、儿茶素（C）、表儿茶素（EC）、表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）和表儿茶素没食子酸酯（ECG），保留时间一致，确认了目标化合物。

**3.3 单因素分析**
- **提取温度**：EGC、C、EC、ECG含量在70°C达最大值，EGCG在50–70°C稳定后于80°C急剧下降，因此选取60–80°C为优化范围。
- **超声时间**：C、EGCG、EGC含量在5–15 min呈抛物线趋势，ECG和EC在10–20 min类似，综合考虑EGCG活性优先，选择5–15 min。
- **液固比**：从25增至55 mL/g时五类儿茶素含量持续上升，但65 mL/g时下降，选择45–65 mL/g。
- **NADES水含量**：20–40%时提取率高且稳定，超过40%后因氢键网络减弱导致效率下降，选择30–50%。

**3.4 RSM模型结果**
基于BBD的29组实验，RSM模型显著（P<0.0001），失拟项不显著，回归方程Y=27.61–0.9517X₁–0.4142X₂–0.4X₃+1.48X₄+0.055X₁X₂–1.04X₁X₃–0.245X₁X₄–0.1375X₂X₃–0.64X₂X₄–0.0525X₃X₄–4.06X₁²–2.55X₂²–2.81X₃²–3.29X₄²。最优条件为68.81°C、9.44 min、39.51%水含量、57.41 mL/g，预测综合评价值27.88 mg/g，与实验值27.94 mg/g接近。

**3.5 GA-BP神经网络模型结果**
GA-BP模型优化得到条件为73.33°C、6.84 min、43.05%水含量、59.82 mL/g，预测值27.72 mg/g。SHAP分析显示温度贡献最大，液固比次之。GA-BP的R²（0.9672）高于RSM（0.9446），RMSE和MSE更低，但验证集偏差较大，表明GA-BP拟合灵活但小样本下稳健性不足，RSM更稳定。最终实际采用73°C、7 min、43%水含量、60 mL/g，6次平行实验均值为25.61 mg/g。

**3.6 不同溶剂绿茶提取物对OA小鼠的保护作用**
在HFD+HDM诱导的OA模型中，NADES_9提取物处理组与模型组相比，H&E染色显示气道结构破坏、炎症细胞浸润和肺泡间隔增厚显著减轻；PAS染色表明杯状细胞增生和黏液分泌减少；Masson染色显示胶原沉积和气道重塑缓解。血清脂质分析显示，NADES_9提取物显著降低总胆固醇（T-CHO）、甘油三酯（TG）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C），升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）。细胞因子检测表明，NADES_9提取物在血清和支气管肺泡灌洗液（BALF）中显著抑制IL-1β、IL-6和TNF-α的升高，效果优于水和乙醇提取物。

**3.7 非靶向代谢组学分析**
主成分分析（PCA）显示NADES_9组与模型组代谢谱明显分离。共鉴定119个上调、195个下调的差异代谢物，主要富集于脂质代谢通路，特别是饱和与不饱和脂肪酸（如油酸、二十碳五烯酸）。KEGG分析表明这些代谢物参与脂肪酸合成、脂质组成和膜稳态相关通路，提示NADES_9提取物诱导脂代谢重编程，可能通过脂质介质调节炎症环境。

**3.8 转录组学分析与分子对接**
转录组PCA显示模型组与NADES_9组分离，鉴定406个差异表达基因（DEGs），包括123个上调、283个下调，其中Nlrp3和Rela显著下调。KEGG富集显示DEGs显著富集于NOD样受体和核因子κB（NF-κB）信号通路。分子对接表明，EGCG和ECG与NF-κB p65（PDB ID: 7RG5）和NLRP3（PDB ID: 8WSM）的CDOCKER能量分别为-43.84/ -41.19 kcal·mol^-1和-66.61/ -53.04 kcal·mol^-1，高于非没食子酰化儿茶素，主要通过氢键和疏水作用稳定结合，提示没食子酰化儿茶素可能调控NF-κB/NLRP3信号。

**3.9 NADES_9提取物抑制NF-κB-NLRP3炎症小体-焦亡信号轴**
蛋白免疫印迹显示，模型组磷酸化p65（p-p65）和磷酸化IκBα（p-IκBα）水平升高，NADES_9处理后显著降低；模型组NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（ASC）、半胱氨酸蛋白酶-1（Caspase-1）和Gasdermin D（GSDMD）蛋白表达升高，NADES_9处理显著下降；模型组IL-1β、IL-6、IL-18和TNF-α升高，NADES_9处理明显降低。这些结果与转录组数据一致，表明NADES_9提取物通过抑制上游NF-κB通路，进而下调NLRP3炎症小体组分及下游细胞因子，整体抑制NF-κB-NLRP3炎症小体-焦亡信号轴。

**讨论与结论**
本研究建立了一种基于UAE-NADES的绿色高效儿茶素提取策略，NADES_9在RSM和GA-BP优化下达到最高产率。在OA动物模型中，NADES_9提取物通过改善脂代谢紊乱、抑制NF-κB/NLRP3信号轴减轻气道炎症和组织损伤。结论部分翻译如下：本研究建立了一种绿色高效的UAE-NADESs策略，用于从龙井绿茶中富集五种主要儿茶素。NADES_9表现出最高的提取效率，并采用RSM和GA-BP神经网络模型优化了工艺参数。在HFD+HDM诱导的OA模型中，NADES_9提取物显著减轻气道炎症，改善组织病理损伤，并调节脂代谢紊乱。多组学和实验验证提示这些效应与调节NF-κB/NLRP3信号轴相关。总之，本研究突出了绿色提取系统与代谢-炎症调节之间基于机制的提取-生物活性关系。该工作为绿茶中生物活性儿茶素的绿色提取提供了新方法，并为OA管理的潜在治疗价值提供了新见解。