《Acta Pharmaceutica Sinica B》：5UTRnet: A deep learning model for designing high-efficiency 5′ UTRs in mRNA therapeutics
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优化5′非翻译区（5′ Untranslated Region，5′ UTR）序列以提高蛋白表达水平，对于充分发挥mRNA（信使核糖核酸）药物的治疗潜力至关重要。研究人员开发了5UTRnet，这是一个集成了预测与重构能力的深度学习框架，用于定制化设计5′ UT
优化5′非翻译区（5′ Untranslated Region，5′ UTR）序列以提高蛋白表达水平，对于充分发挥mRNA（信使核糖核酸）药物的治疗潜力至关重要。研究人员开发了5UTRnet，这是一个集成了预测与重构能力的深度学习框架，用于定制化设计5′ UTR。研究人员设计了一种两阶段（Two-Stage）训练方法来准确预测平均核糖体负载（Mean Ribosome Load，MRL）。此外，研究人员引入了一种创新的梯度生成（Gradient-Generation）优化算法，以设计具有高空载核糖体负载的不同长度的5′ UTR。在不同系统中的实验验证表明，由5UTRnet生成的5′ UTR相比人工设计的基准序列显著增强了蛋白表达。表现最优的5′ UTR序列UTRnet2，随后在预防性疫苗模型中引发了更优的特异性抗体滴度，并在治疗性疫苗环境中诱导了强效的抗肿瘤功效，强调了UTRnet2强大的转化潜力。综上，本研究确立5UTRnet作为一种通用且高性能的工具，用于合理的5′ UTR工程化改造，从而加速新型mRNA治疗药物的开发。
该研究发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》。研究背景方面，mRNA治疗药物为包括传染病、遗传病和癌症在内的广泛疾病提供了多功能且有效的平台，其中mRNA疫苗在COVID-19全球成功后备受关注。推进mRNA治疗药物的核心挑战在于实现稳健的蛋白表达，而5′非翻译区（5′ Untranslated Region，5′ UTR）是调节翻译的主要元件之一，其长度、序列和结构异质性在基因表达调控中起关键作用。传统5′ UTR设计方法劳动密集、成本高昂且受限于巨大的序列组合可能性，加之5′ UTR特征与核糖体及细胞机制间复杂的相互作用使得功能预测困难，现有深度学习模型虽在5′ UTR功能预测上有潜力，但同时支持固定和可变长度序列生成与优化且兼顾计算效率的模型仍稀缺。因此，研究人员开展本研究旨在构建能同时解决5′ UTR功能预测与序列优化、保持在可接受计算资源范围内、增强模型实用性的机器学习模型。
为开展研究，研究人员主要采用的关键技术方法包括：使用来自Sample等人的合成文库数据集（含280,000条随机5′ UTR序列及对应读数和MRL值，含50 nt固定长度EGFP与mCherry文库及25至100 nt可变长度文库）进行数据收集与零填充、one-hot编码预处理；构建基于两阶段（Two-Stage）结构的5UTRnet模型，其包含编码器（Encoder）、预测头（PredHead）和解码器（Decoder）模块，编码器与解码器主干为3层UNet，PredHead为18层ResNet，去除编解码间跳跃连接；采用两阶段训练（监督训练阶段最小化加权均方误差WMSE预测MRL，自监督训练阶段最小化二元交叉熵BCE损失进行序列重构）与联合训练两种策略；设计梯度生成（Gradient-Generation）优化算法与改进的高斯生成（Gaussian-Generation）算法进行5′ UTR序列迭代生成，排除含上游AUG（uAUG）或终止密码子序列；以决定系数（R-squared）和准确率（ACC）为评估指标。
研究结果如下：
3.1. Prediction of 5′ UTR's MRL value。研究人员在多个5′ UTR序列库上训练5UTRnet与基准模型（UTR-LM、Smart5UTR、Optimus 5-Prime、FramePool），结果显示5UTRnet-Two在50 nt固定长度测试集、Random与Human可变长度测试集及独立mCherry测试集上MRL预测R-squared均优于基准模型，在1-甲基假尿苷库测试集达0.815，较Smart5UTR、FramePool、Optimus 5-Prime分别相对提升，且与UTR-LM性能相当但推理时间更优；其序列重构准确率在相同训练周期内达更高水平，Smart5UTR仅约较低水平。模型预测分布显示含ATG基序序列对应较低翻译效率、无此信号序列MRL更高，符合上游开放阅读框（uORF）抑制翻译起始的已知原理；UMAP降维显示不同MRL区间序列在潜空间形成清晰聚类，表明编码器捕获了与效率相关的生物信号。在两独立mCherry测试集上5UTRnet-Two R-squared分别为0.627和0.711，预测能力较EGFP库下降，提示受开放阅读框（ORF）影响。5UTRnet-Two在各测试中均优于联合训练模型，两阶段训练避免了预测（回归）与重构（分类）任务目标差异冲突。
3.2. Designing novel 5′ UTR sequences。研究人员基于5UTRnet-Two从测试集选取含或不含有上游AUG（uAUG）或终止密码子的固定及可变长度5′ UTR进行优化。结果显示梯度生成法优化的序列MRL分布普遍高于高斯生成法；含uAUG或终止密码子的次优初始点下两算法优化能力均下降，部分序列首次迭代即无法更新，长度影响优化过程，含不良元件时两算法性能差异放大，梯度生成法鲁棒性更好。追踪不同长度代表序列迭代过程发现，梯度生成法早期MRL增长更快，5至10次迭代后增速放缓但全程维持更高MRL，相同迭代次数下产出序列MRL一致高于高斯生成法。
3.3. Validation of the predictive and generative performance of 5UTRnet across multiple protein expression systems。研究人员通过重叠PCR合成目标5′ UTR并插入hEPO质粒进行体外转录，在细胞（HEK293T）、无细胞系统和小鼠体内验证。HEK293T细胞中固定与可变长度5′ UTR预测MRL与实际hEPO表达水平R-squared分别为0.8521和0.8077，表明模型预测准确；高斯生成法优化固定长度50 nt序列显著提升蛋白表达，但对可变长度无显著提升，而梯度生成法优化序列均显著提升蛋白表达，凸显其对可变长度优化优势。
3.4. Selection of optimal 5'UTR sequences。研究人员将5UTRnet生成序列与人工设计高性能序列NCA-7d比较，在无细胞、小鼠血清及脏器中hEPO表达趋势与预测MRL一致，选出MRL为7.56和7.75的UTRnet1与UTRnet2；小鼠血清中两者蛋白表达均高于NCA-7d，24小时内UTRnet2组肝脏hEPO表达超NCA-7d两倍，脾脏中UTRnet2最高、UTRnet1次之；FLuc-mRNA体内分布显示荧光集中于肝脾，UTRnet2组肝脏荧光为NCA-7d三倍，脾脏约为九倍；RSV pre-F mRNA疫苗中UTRnet2诱导的特异性IgG抗体滴度显著高于Optimus 5-Prime与UTR-LM生成序列及其他基准序列。
3.5. 5UTRnet-designed superior 5′ UTR benefited tumor vaccine in mice。研究人员在E.G7-OVA淋巴瘤小鼠模型评估含UTRnet2的OVA-mRNA疫苗抗肿瘤效力，于第0、3、8天静脉注射10 μg疫苗，第14天评估。结果显示PBS与EGFP组肿瘤体积随时间显著增加，NCA-7d组第14天肿瘤生长减少约58%，UTRnet2组减少约79%；瘤重趋势同体积；流式细胞术显示UTRnet2组肿瘤、脾脏、淋巴结中OVA特异性CD8+T细胞频率均最高且显著高于NCA-7d组；组织学分析示NCA-7d与UTRnet2组肿瘤组织坏死明显，Ki-67阳性减少、TUNEL阳性增加，UTRnet2组增殖抑制最强、凋亡最高；体重、血清生化及脏器H&E染色未见异常，表明UTRnet2安全且具有强效体内抗肿瘤功效。
讨论部分总结：研究人员指出mRNA疫苗成功获批凸显潜力，高效翻译是关键，5′ UTR为核心调节元件，MRL为主要指标，传统筛选受限，故开发5UTRnet。模型预测与优化性能优异，梯度生成算法高效引导生成高空载核糖体负载序列并规避不良元件，多系统验证准确，筛选出UTRnet2在预防与治疗疫苗中具应用潜力。同时提出局限：MRL与终末蛋白表达存差异，未来需构建关联实际蛋白输出数据集；当前变长约束25至100 nt未涵盖内源5′ UTR中位长度218 nt，模型架构长度无关但扩展需重训调参，未来需整合任意长度处理；模型仅基于单一细胞类型数据训练，未来需扩展至多细胞多条件验证泛化；梯度生成算法迭代性质禁批量处理限制规模化，未来可借鉴扩散模型；仅聚焦5′ UTR与MRL，翻译受全转录本上下文影响，未来需整合CDS、3′ UTR及稳定性、免疫原性等综合优化。
结论部分翻译：本研究提出的新型5UTRnet模型集成了5′ UTR平均核糖体负载（Mean Ribosome Load，MRL）的准确预测与增强翻译效率的5′ UTR序列优化。在其设计过程中，研究人员创新性地引入了梯度生成（Gradient-Generation）算法，实现了可变长度序列（25–100 nt）的高效优化，性能优于基准模型。5UTRnet的效力在包括无细胞、细胞和鼠类系统的多种蛋白表达系统中得到验证。随后，5UTRnet生成的优化5′ UTR序列（UTRnet2）被用于构建编码RSV pre-F蛋白或经典肿瘤抗原OVA的mRNA，证明了UTRnet2在预防性病毒疫苗与抗肿瘤免疫中的广阔潜力。这些发现凸显了5UTRnet作为合理设计具良好实用性的mRNA疫苗的强大工具。
