CMTM6维持B细胞内在膜CD40稳定性以调控抗肿瘤免疫

《Acta Pharmaceutica Sinica B》：CMTM6 maintains B cell-intrinsic membrane CD40 stability to regulate anti-tumor immunity

　　

B细胞和B细胞内在分子在肿瘤免疫中的关键作用开始被认识。肿瘤细胞CKLF样MARVEL跨膜结构域蛋白6（CMTM6）是一种新型肿瘤免疫调节因子，参与维持多个重要分子的膜水平，如程序性细胞死亡配体1（PD-L1）和CD58。宿主CMTM6也可能在肿瘤微环境中发挥作用。本研究中，研究人员发现CMTM6在脾脏B细胞和肿瘤浸润B细胞中高表达。CMTM6缺失导致脾脏发育受损、生发中心B细胞分化受损、记忆B细胞分化受损、T/B细胞相互作用受损以及B细胞抗肿瘤免疫应答受损。通过多组学数据挖掘和B细胞激动剂筛选，研究人员发现CMTM6与CD40相互作用并维持B细胞中CD40的膜水平。CMTM6与CD40顺式相互作用，抑制泛素/蛋白酶体介导的CD40降解。CMTM6缺失导致CD40信号介导的B细胞活化、存活、增殖、分化和T/B细胞相互作用受损。体内实验中，CMTM6缺失导致免疫检查点阻断（immune checkpoint blockade, ICB）疗法和B细胞依赖性CD40激动剂的抗肿瘤活性显著降低。总之，B细胞内在的CMTM6维持B细胞CD40水平和信号传导，从而促进B细胞功能和抗肿瘤免疫。

论文解读文章

**研究背景与问题**
B细胞在肿瘤免疫中的作用长期被低估，以往研究多关注其促肿瘤效应，但近年发现肿瘤浸润B细胞（TIL-B）和三级淋巴结构（TLS）与免疫检查点阻断（ICB）疗效及抗肿瘤CD8⁺T细胞活化密切相关。然而，B细胞功能的分子调控机制尚不明确。CMTM6作为新型肿瘤免疫调节蛋白，已知通过维持肿瘤细胞膜上PD-L1和CD58的稳定性调控T细胞免疫，但在免疫细胞中的表达和功能缺乏系统研究。本文旨在探究CMTM6在B细胞中的表达、对B细胞抗肿瘤免疫的调控作用及机制。

**研究意义**
该研究发表于《Acta Pharmaceutica Sinica B》，揭示了CMTM6通过维持B细胞CD40膜稳定性调控B细胞分化、功能及抗肿瘤免疫，并影响CD40激动剂和ICB疗法的疗效，为以B细胞为靶点的肿瘤免疫治疗提供新视角。

**主要关键技术方法**
研究人员利用公开单细胞测序数据（GEO数据库）分析CMTM6表达，采用Cmtm6基因敲除（KO）小鼠（全身KO及CD19-Cre条件性KO）和过继转输实验评估B细胞功能；通过流式细胞术检测B细胞亚群、活化、分化及CD40膜水平；使用Co-IP、免疫荧光共定位、AlphaFold2结构预测及泛素化降解实验解析CMTM6与CD40的相互作用机制；应用CD40L阻断抗体和Cd40 KO小鼠验证CD40信号依赖性；建立多种皮下肿瘤模型（CT26、B16F10、MC38）评估抗肿瘤效果。

**研究结果**
**3.1 B细胞影响肿瘤微环境和抗肿瘤T细胞应答**：通过抗CD20抗体删除B细胞，发现B细胞缺失导致肿瘤内白细胞及CD4⁺、CD8⁺T细胞浸润减少，引流淋巴结中T细胞效应分子（IFN-γ、GzmB、穿孔素）表达下降，表明B细胞总体具有抗肿瘤作用。

**3.2 CMTM6在外周和肿瘤B细胞中表达**：单细胞测序和流式细胞术显示CMTM6在人和小鼠外周血及肿瘤浸润B细胞中高表达。

**3.3 CMTM6是B细胞抗肿瘤免疫的潜在调节因子**：Cmtm6 KO小鼠脾脏缩小、脾指数降低；RNA-seq显示差异基因富集于B细胞激活通路。体内实验中，抗CD20删除B细胞后，Cmtm6 KO小鼠肿瘤增长更快；过继输注CMTM6缺陷B细胞不能抑制肿瘤生长，且其促进T细胞应答的能力受损。

**3.4 CMTM6影响T/B细胞相互作用**：B细胞条件性KO（BKO）小鼠中B16F10和MC38肿瘤加速生长，引流淋巴结CD4⁺和CD8⁺T细胞效应分子降低。体外共培养显示CMTM6缺陷B细胞对OT-II CD4⁺T细胞的活化和增殖促进能力显著减弱。

**3.5 CMTM6影响B细胞分化**：流式细胞术显示Cmtm6 KO小鼠脾脏和淋巴结中非类别转换记忆B细胞、类别转换记忆B细胞和生发中心（GC）B细胞比例显著下降（GC B细胞降幅69.01%），且该效应独立于PD-L1。

**3.6 CMTM6影响CD40介导的B细胞活化**：通过TLR4/TLR7/TLR9/BCR/CD40五种激动剂筛选，发现仅CD40激动剂作用下CMTM6缺陷B细胞活化标志物（CD69、CD86、MHC II）显著降低，提示CMTM6通过CD40通路调控B细胞免疫。

**3.7 CMTM6维持B细胞中CD40的膜水平**：流式检测显示Cmtm6 KO小鼠脾脏和淋巴结多种B细胞亚群膜CD40水平下降约30%，该效应独立于PD-L1；人PBMC B细胞中敲低CMTM6同样降低CD40水平；而CD80、CD86、MHC II水平不受影响。

**3.8 CMTM6维持B细胞中CD40的功能**：磷酸化流式显示CMTM6缺陷B细胞中CD40下游p65和p38磷酸化水平降低；CD40激动剂介导的B细胞存活、增殖（CCK8）和向GC B细胞分化能力均受损。

**3.9 CMTM6依赖CD40信号调控B细胞功能**：CD40L阻断抗体能消除BKO与对照组在T/B细胞共培养中的差异，且体内阻断CD40L后BKO小鼠肿瘤生长差异消失，GC B细胞比例和CD8⁺T细胞效应分子差异亦消除。Cd40 KO B细胞过继转输完全失去抗肿瘤活性，且Cmtm6&Cd40双KO未进一步加重损伤，证实CMTM6以CD40依赖性方式调控B细胞功能。

**3.10 CMTM6是CD40的相互作用分子**：RNA-seq显示Cmtm6 KO不影响Cd40 mRNA水平；Co-IP证实CMTM6与CD40直接结合；膜CD40降解实验表明CMTM6通过抑制泛素/蛋白酶体途径（而非溶酶体途径）维持CD40稳定性，且CMTM6缺失后CD40泛素化水平升高。AlphaFold2预测人鼠CMTM6/CD40复合物结构，主要相互作用区域位于CMTM6的第一跨膜域（TM1）、第二跨膜域（TM2）和第一胞外域（ECD1），CD40则位于跨膜域及近膜区；点突变实验验证了关键位点。

**3.11 B细胞CMTM6影响CD40激动剂的抗肿瘤疗效**：B细胞删除显著削弱CD40激动剂抗肿瘤活性；Cmtm6 KO小鼠中CD40激动剂疗效降低；BKO小鼠对CD40激动剂和PD-1抑制剂的应答均显著减弱。公开单细胞RNA-seq数据分析显示，ICB治疗应答者肿瘤浸润B细胞中CMTM6表达高于非应答者。

**讨论与结论**
讨论部分总结了B细胞在肿瘤免疫中角色的转变，指出本研究支持B细胞总体具有抗肿瘤作用，且CD40激动剂依赖B细胞发挥疗效。CMTM6被鉴定为B细胞内在CD40的新调节分子，通过维持CD40膜水平调控下游信号及B细胞功能。CMTM6可能作为分子伴侣蛋白维持多种跨膜蛋白稳定性。研究局限性包括未在原位肿瘤模型和免疫人源化模型中验证，未充分探索其他免疫细胞中CMTM6-CD40轴，缺乏更严格的CD40拯救实验，以及未来需进行无偏膜蛋白质组学筛选。

结论部分翻译：本研究表明，B细胞内在的CMTM6通过翻译后修饰途径维持B细胞膜CD40水平，从而调控CD40信号和功能，进而影响B细胞分化和功能、抗肿瘤B细胞免疫以及CD40激动剂的疗效。这些研究将拓展对B细胞抗肿瘤作用和CD40调控机制的认识，阐明CMTM6在肿瘤微环境（tumor microenvironment, TME）中的作用和机制，并激发B细胞CMTM6在潜在临床应用中的价值。